恒定低温对不同品系关玉竹组织抗冷性的影响(2)

　　本试验温度数据采集系统使用多点生物温度仪（Yaxin-0233，北京雅欣理仪科技有限公司），其测温范围-40～100 ℃，精度±0.1 ℃，各传感器提前经过二等标准水银温度计校准;降温冰箱为医用低温保存箱（DW-25L-92，海尔集团）;徒手切片器（27009，余姚市学友教学仪器有限公司）。

　　2方法

　　2.1组织抗冷性测定参照Meng Q R等^[4]的方法有改动，选取无病斑，无外伤的关玉竹，利用多点生物温度仪在线绘制关玉竹芽孢、1年根状茎、2年根状茎、3年根状茎的冻结曲线。多点生物温度仪与电脑相连接，启动工作站，设定数据采集间隔为200 ms，温度传感器分出2根探针（测量端、参考端）：用测量端刺于测定部位;将参考端放入有冰水混合物的保温桶中，并保持参考端温度为0 ℃。将测量端及关玉竹从室温移至-30 ℃冰箱中，重复10次。关玉竹突然降温过程通过软件实时显示在计算机上。为减少误差，每次插针标准相同。

　　2.2关玉竹水分组成测定关玉竹组织进行切片，片厚0.6 mm，切片后迅速按照张治安等^[5]测定组织含水量、自由水（free water，FW）及束缚水（bound water，BW）含量方法进行测定。

　　2.3数据处理采用Excel（2007）软件对数据进行初步筛选;利用SPSS 19.0中的单因素方差分析（One-way ANOVA）结合LSD法（α=0.05）对统计结果进行显著性方差分析，运用SPSS 19.0中的双变量相关分析对数据进行相关性分析，运用DPS 7.05中的灰色关联分析法对数据进行综合分析，采用Graphpad Prism 5作图。

　　3结果与分析

　　3.1冻结曲线的绘制相同冻结温度（30 ℃）下^[6]，关玉竹冻结曲线见图1。关玉竹置于冷空气中，各器官温度迅速下降，达到成核温度（nucleation temperature，NTem）;随着时间的推移，当晶核尺寸超过成核临界尺寸时，冷却过程停止，同时依靠向系统中释放热量的方式形成冰核，达到初始冷冻温度（initial freezing temperature，IFT）;温度在经过一段斜率近似为0的阶段后，到达瞬时斜率最大时结束冷却。此图与王伟^[7]、P Comandini^[8]所绘制曲线有所差异。

　　通常过冷点（SCP）是指关玉竹体内液体在液态状态下的最低温度，即成核温度（NTem）;冰点（FP）是关玉竹在冷却过程中冰生长时候的温度，即初始冻结温度（IFT）;温度曲线斜率最大时为冷却温度（global freezing process temperature，FTem）;冰点与过冷点之间的差值即为过冷度（supercooling degree，SCD），过冷度越大，过冷点越低，植物的抗冷性越强;过渡阶段时间（transition phase time，TPtime）为到达冰点后，温度曲线斜率近似为0时所持续的时间，同时也是冷却时间（global freezing process time，Ftime）与成核时间（nucleation time，Ntime）之间的差值;过渡阶段时间内的成核高峰即为成核峰（nucleation peak，NP）;冷却时间（Ftime）是整个降温过程所持续的时间，即从开始降温，经过冰点到达温度曲线瞬时斜率最大时所持续的时间^[7]。由于室温变化大，故本试验拟定4 ℃为初始降温点。

　　3.2关玉竹芽孢抗冷性比较关玉竹具有茎秆当年不可再生性。对5种关玉竹芽孢各冻结评价指标进行比较见图2、表1。不同品系关玉竹芽孢冻结评价指标有所差异。小圆叶具有较高的过冷点、冰点、成核峰;吉竹1号具有较大的过冷度;大圆叶、长叶和小圆叶的冷冻结束温度较低。

　　表1表明，紫茎长叶的成核时间较其余关玉竹有显著性延长，过渡阶段时间上吉竹1号较其余关玉竹有显著性缩短。

　　3.3一年生关玉竹根状茎组织抗冷性比较关玉竹芽孢生长在一年生根状茎前端，一年生根状茎保证了芽孢在返青时期的养分供给，所以研究关玉竹一年生根状茎的组织抗冷性对关玉竹抗冷研究有重要意义。紫茎长叶及长叶的过冷点低、冰点低、成核峰低和成核时间长，各种关玉竹过冷度无明显差异;大圆叶和长叶冷却温度较低，大圆叶过渡阶段时间长，见表2。

　　3.4不同部位关玉竹组织抗冷性比较紫茎长叶关玉竹的各部位冻结曲线各有差异，芽孢具有一个明显的突越点，而其余部位突越点不明显;关玉竹根状茎随年限增加突越点越来越不明显、冷冻时间增长，其可能与不同部位关玉竹水分组成及组织中溶液浓度有关，见图3。

　　3.5水分组成与关玉竹组织抗冷性的关系鉴于3.4研究，对紫茎长叶芽孢及一年生根茎水分组成进行测定，并分析水分与抗冷性之间的相关性，见表3，4。芽孢的过冷点、冰点和过冷度与其含水量、自由水含量成正相关。过冷点与含水量、自由水含量的相关系数分别为0.487，0.491;冰点与含水量、自