中医证本质研究与代谢组学技术：现状与思考(2)

　　４．１．３　气虚血瘀证　李林等［１５］依据中医“劳则气耗”的理论，采用睡眠剥夺法制作大鼠气虚血瘀模型，利用ＮＭＲ进行尿液代谢组学研究。结果显示，中西医结合学报２０１２年１０月第１０卷第１０期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１２，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１０ ·１０７１·模型组大鼠尿液的肌氨酸酐含量增加最为明显，可能预示着肾小管损伤和肾毒性的存在，提示气虚证可能与肾功能异常有着密切关系；同时，氧化三甲胺、柠檬酸、α－酮戊二酸、琥珀酸的含量变化可能预示着肾髓质毒性的存在。这与中医论述“劳则气耗”

　　所致的气虚血瘀证表现出的全身机能减退症状以及循环系统改变有一定的吻合之处。王勇等［１６］通过在左冠状动脉前降支放置Ａｍｅｒｏｉｄ缩窄环制备冠心病慢性心肌缺血小型猪模型，并结合宏观体征、冠状动脉造影和超声心动图等方法确立了气虚血瘀证，采用ＧＣ－ＭＳ和模式识别技术，分析冠心病心肌缺血气虚血瘀证模型与假手术组小型猪１２周血浆的代谢物及相应代谢物谱群的变化。结果显示，在气虚血瘀证早期，氨基酸、糖代谢与脂类代谢紊乱，三者相互作用，引起能量代谢中三羧酸循环平衡被破坏，柠檬酸含量下降。这些病理改变可能进一步加重冠心病气虚血瘀证，其中柠檬酸、葡萄糖、硬脂酸、棕榈酸、甘油、醋酸等化合物的浓度变化较大，这些代谢物的变化模式有望成为临床诊疗冠心病气虚血瘀证的参考指标，并为研究证候的客观化提供新的思路。

　　４．１．４　肾阳虚证　Ｃｈｅｎ等［１７］采用注射氢化可的松的方法制作大鼠肾阳虚证模型，运用ＧＣ－ＭＳ分析方法进行尿液代谢组学研究。与正常组相比，模型组体内代谢网络在代谢图上反映出不同于正常组的分布图谱。而经温阳中药肉苁蓉干预后的肾阳虚对照组的代谢图谱偏离模型组，回归至正常范围，呈现网络修复的结果，并接近于正常对照组。表明代谢组学通过研究体内代谢网络的相应变化及代谢物的差异，有望在中医证型研究上作为一种新的可“计量”的诊断或评价手段，对基于“辨证论治”的中药药效作用评价具有较大的应用价值。

　　４．１．５　肺热证　卢江等［１８］以肺炎链球菌诱导肺热证候模型，运用超高压液相色谱－四级杆－飞行时间质谱对其尿液代谢组学进行检测。结果显示，模型组大鼠尿液的代谢轮廓发生改变，并且在得分图中代谢物组发生明显偏移。随着造模后所处时间段的不同，其代谢产物发生了一定的变化，分类趋势越加明显，在造模后第５天达到最大值。所得出的代谢组学研究结果与肺热证候的宏观体征及病理生化指标结果相符。

　　４．２　基于疾病的证本质研究

　　４．２．１　高血压病　蒋海强等［１９］对１７例Ⅱ级高血压病肝阳上亢证患者及８例健康志愿者的血清样本进行ＮＭＲ分析发现，肝阳上亢证患者体内部分氨基酸代谢和葡萄糖代谢明显异于健康志愿者，这为理解高血压病肝阳上亢证的证候本质及该类病证的辅助诊断提供了依据。陆益红等［２０］对３２例健康人及３３例原发性高血压病患者（其中肝火亢盛１７例、痰湿雍盛８例及阴虚阳亢８例）的血清内源性代谢物进行ＧＣ－ＭＳ测定，健康人与高血压病患者的血清代谢物谱具有明显差异，进一步采用Ｍａｈａｌａｎｏｂｉｓ距离判别法不仅可清晰区分３种不同证型的高血压，还能显示高血压的发展过程。

　　４．２．２　冠心病　简维雄等［２１］采用ＧＣ－ＭＳ技术对６例冠心病心血瘀阻证患者、１６例非心血瘀阻证患者及１０例健康志愿者血浆代谢产物进行检测发现，花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、柠檬酸、β－羟基丁酸、油酸、葡萄糖和丙氨酸为冠心病心血瘀阻证患者的血浆差异代谢产物，其不仅与脂质代谢、糖代谢相关，也与缺氧、剧痛引起的应激相关。张红栓等［２２］对１０例冠心病心绞痛痰浊证患者和１０例血瘀证患者的血浆样本进行ＮＭＲ检测，发现两组血浆样本中与能量代谢相关的代谢物差异显著。王广基等［２３］采用气相色谱－飞行时间质谱（ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔｉｍｅｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ／ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ）技术对２９例冠心病痰阻心脉证患者、１４例冠心病气阴两虚证患者及２７例健康志愿者的血液样本进行检测。结果表明，两证型患者的多个内源性代谢物的含量存在明显差异，显示其与能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢异常相关；同时，利用偏最小二乘法判别分析（ｐａｒｔｉａｌ　ｌｅａｓｔ　ｓｑｕａｒｅｓ－ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＬＳ－ＤＡ）法建立的痰阻心脉证和气阴两虚证数学模型参数与临床中医症状分级量化指标具有显著的相关性，提示代谢组学所研究的体内小分子化合物可能正是中医分型的物质基础。华何与等［２４］对１８例健康人和１８例冠心病心绞痛血瘀证患者（其中气滞血瘀证、心血瘀阻证和气虚血瘀证各６例）的血浆样本进行ＮＭＲ检测，发现心绞痛血瘀证患者血浆的柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖、乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、３－羟基丁酸、谷氨酸、脯氨酸及亮氨酸含量较高，高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、苏氨酸、组氨酸含量则较低；进一步分析发现，气虚血瘀证组与其他两类血瘀证组代谢谱差别较大，而气滞血瘀证与心血瘀阻证两组间差异不明显，提示代谢组学方法对于研究冠心病心绞痛中医证候具有重要价值。朱萱萱等［２５］对２９例健康志愿者和９０例不同证型冠心病患者（其中痰阻心脉型患者３１例，气阴两虚型患者１８例，气虚血瘀型患者２９例及气滞血瘀型患者１２例）的血清进行ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ检测，结合ＰＬＳ－ＤＡ 法。结果表明，该方法不仅可有效区分疾病组和健康对照组，并能将男性患者中的·１０７２· 中西医结合学报２０１２年１０月第１０卷第１０期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１２，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１０气虚血瘀型和痰阻心脉型，女性患者中的气虚血瘀型、痰阻心脉型和气阴两虚型明显区分开来，提示基于ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ和模式识别的代谢组学技术在揭示传统中医理论本质上有着广泛的应用前景。

　　４．２．３　哮喘　严兴海等［２６］对３９例肾虚痰瘀型哮喘患者和４０例健康人的血浆进行ＮＭＲ检测，发现肾虚痰瘀型哮喘患者代谢产物标志物的产生不仅与气道炎症、气道超敏反应和气道重塑等哮喘病理生理变化密切相关，还与哮喘发作状态下机体的能量代谢改变有关，提示肾虚痰瘀型哮喘患者可能存在长期持续耗能与免疫功能紊乱的状态，而气道炎症持续刺激可能是导致这种状态的主要原因。这为进一步认识肾虚痰瘀型哮喘的微观物质基础、评价中医药对肾虚痰瘀型哮喘的干预效果提供了初步的证据。

　　４．２．４　其他病证　巴吐尔·买买提明等［２７］通过对４６０例肿瘤患者（包括痰瘀证患者３５６例和非痰瘀证患者１０４例）和５０名健康人的血浆进行ＮＭＲ检测，发现肿瘤患者血浆中多种氨基酸水平显著下降，葡萄糖、糖蛋白、谷氨酰胺、鲨肌醇、乳酸、胆碱、肌酸水平也明显下降，甲酸、丙酮、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、β－羟丁酸、肉碱、丙二酸、不饱和脂肪酸、极低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量则明显升高。与非痰瘀证肿瘤患者比较，痰瘀证肿瘤患者血浆中亮氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、组氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等多种氨基酸以及谷氨酰胺、肌醇、鲨肌醇、乳酸、肌酸等代谢物含量明显偏低，而丙酮、乙酰乙酸、不饱和脂肪酸、极低密度脂蛋白、α葡萄糖、β葡萄糖、糖蛋白等代谢物含量则明显升高，提示肿瘤患者体内脂肪代谢加强，多种氨基酸下降，细胞抗氧化能力下降，而痰瘀证肿瘤患者体内的代谢紊乱程度可能比非痰瘀证肿瘤患者更为严重。赵晓山等［２８］采用病证结合的方法，以慢性胃炎和消化性溃疡患者为观察对象，应用ＮＭＲ仪对１９例脾气虚证患者、１２例湿热蕴脾证患者及１２例健康人的唾液进行检测发现，脾气虚证组患者唾液中谷氨酰胺、蔗糖、乳酸盐、苯丙氨酸的含量相对较高，湿热蕴脾组患者唾液中乙酸、丙酸盐、牛磺酸的含量相对较高。以上物质可作为脾气虚证、湿热蕴脾证的辨证参考指标，同时在一定程度上印证了中医“脾在液为涎”理论的科学性。

　　５　对代谢组学技术用于证本质研究的思考

　　证是中医整体观和辨证论治观的具体体现，更

　　是中医基础理论研究中的关键科学问题。但证候所具有的整体性、时空性、个体差异性等特点，使得传统以还原论为主的研究思维难以实现对证候研究的降维与整合，这也使证本质研究成为中医理论研究中的主要难点之一。作为系统生物学的代谢组学，它能够多层次、多靶点、动态性地研究和表达集体的功能状态，可以通过代谢物的变化实时表达外源性扰动带来的功能变化，其整体性及动态的功能性与中医证候对病理状态的表达理念相吻合。因此，将代谢组学理念与方法引入中医证本质研究具有重要的现实意义。

　　当前，代谢组学技术应用于中医证本质的研究

　　虽然已取得了一定成果，但仍存在诸多不足。如通过制备相应证候的动物模型来进行证本质研究，虽然动物模型有一致性好、条件可控、观察周期快、取材方便等诸多优势，但目前多数中医证候的动物模型尚难以得到业内公认。例如，在动物证候模型判定上，传统中医通过望、闻、问、切来进行诊断，其方法显然难以复制于动物；同时，仅靠某种方法或某种药物来造模的动物能否真实反映人体复杂证候类型，即使被认为制作方法非常稳定、重复性很好、用得也很普遍的证候模型，能够在多大程度上模拟相应的人体证候，恐怕也是很难说得清楚。因此，通过构建相应动物模型来分析、验证、解释中医证候与相关代谢指标的关系仍存有很多疑问。

　　当然，不少研究者都已意识到这一点，转而从临床角度直接进行中医证的相关研究。但目前多数临床研究病例数偏少，且同一证候的宏观诊断标准不一，临床研究中存在合并病（症、证）、性别差异、用药干预等的困扰，使得这些数据往往难以得出令人信服的结果，而且其结果的重复性也存在较大问题。

　　今后在中医证型临床研究中要进一步扩大样本量，并严格掌握其证候诊断标准，制定相应质量控制标准（如制定纳入与排除标准、限制受试者饮食及生活方式等），以保证临床研究结果的可靠性与可重复性。

　　其次，随着代谢组学在证本质研究中的不断推

　　广，临床检测中产生了大量的数据，如何对这些数据进行科学解读与分析，是摆在我们面前的又一个巨大难题。当前，数据处理已经成为代谢组学研究中的关键技术和瓶颈之一，虽然目前用于代谢组学分析的方法不断完善，但不同方法的适用范围和优缺点各不相同。例如主成分分析是代谢组学中最常规的分析方法，能找出各主成分就能进行数据降维，但可能导致一些有用数据的丢失；偏最小二乘法用于建立预测回归方程，但只能作定性分析，并尽量减少解释变量；而人工神经网络在处理规律不明显、组分变量多的问题方面却具有特殊的优越性［２９］。因此，中西医结合学报２０１２年１０月第１０卷第１０期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１２，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１０ ·１０７３·必须将它们有机地结合起来，并寻找更多更有效的统计分析方法，才有可能为代谢组学的数据提供有效的处理平台。最后，代谢组学只是系统生物学的一个组成部分，只有将代谢组学数据同基因组学、转录组学、蛋白质组学等系统生物学的方法与数据相对接，才能实现对生物体结构与功能的整体、动态把握。因此，这也是代谢组学用于证本质研究的发展方向。