四物汤对Caco—2细胞P—糖蛋白功能和表达的影响(2)

　　2.3 药液安全浓度的考察 使用MTS试剂盒检测四物汤水煎液给药24，48，72 h后Caco-2细胞的存活率。将细胞密度为2×104个/cm2接种到96孔板中，每孔200 μL，于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，小心吸尽培养液，加入配置不同浓度的四物汤水煎药液（含生药质量浓度为0.625，1.25，2.5，5，10，20 g·L-1）200 μL，空白培基为对照组，每组设置6个复孔，在37 ℃，5%CO2细胞培养箱中分别孵育24，48，72 h后，每孔加入8 μL MTS，在细胞培养箱中继续孵育3 h，然后在多功能酶标仪检测490 nm处的吸光度（A）。按下列公式计算细胞的相对存活率=（A实验组-A溶剂对照组）/（A空白对照组-A溶剂对照组）×100%。
　　2.4 荧光定量PCR检测MDR1基因的表达 将对数生长期Caco-2细胞分为四物汤水煎液（SWT）不同剂量组（3.3，5.0，10.0 g·L-1）、维拉帕米（Ver，100 μmol·L-1）、利福平（Rif，20 μmol·L-1）阳性对照组、空白对照组（细胞培养基）。受试药分别作用于Caco-2细胞24，48，72 h后收集细胞。利用Trizol试剂提取细胞总RNA。紫外分光光度计法测定RNA浓度，测定吸光度A260/A280的比值，测定值在1.8～2.0，说明制备的总RNA 较为纯净。以2 μg RNA 为模板，加入到20 μL RT反应体系中，按照反转录试剂盒操作制备cDNA，Q-PCR具体操作参照说明书进行，荧光实时定量PCR扩增的循环条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。以GAPDH作为内参基因，进行PCR扩增的实时定量分析。mRNA表达水平采用比较阈值法进行定量分析[11]。特异性引物序列见表1，引物特异性由BLAST评价，溶解曲线检测，表明引物特异性强。
　　2.5 流式细胞仪检测Caco-2细胞P-gp外排功能 给药分组与2.4项相同。分别于37 ℃，5%CO2培养箱中用含药培养基中培养1，48 h，PBS洗2次，弃上清，用胰酶消化，收集细胞转入1.5 mL EP管中，4 ℃下2 500 r·min-1离心5 min，弃上清，PBS洗2次，离心弃上清。每管加入罗丹明123（终浓度为10 μmol·L-1），重悬后在37 ℃，5%CO2培养箱中培养60 min，置冰上终止作用，4 ℃下2 500 r·min-1离心5 min，弃上清，用预冷的PBS洗2次，离心弃上清。加PBS 300 μL轻轻吹打，制成单个细胞悬液。在激发波长为466 nm、发射波长为535 nm条件下选择FITC通道测定2万个细胞，收集535 nm处的罗丹明123荧光进行分析，分析时除去细胞碎片和细胞团块对测定的干扰，实验重复3次。按下列公式计算罗丹明123的相对荧光强度=A实验组/A空白对照组×100%。
　　2.6 Western blotting法检测P-gp的表达 给药方案与2.4项相同，加药后在37 ℃，5%CO2培养箱培养48 h，用PBS洗2次，弃上清，用裂解液RIPA裂解细胞，提取总蛋白，按试剂盒方法操作，绘制标准曲线并计算各样品中蛋白的量。SDS-PAGE蛋白质电泳，每个样品取含蛋白60 μg的体积，进行电泳，转膜，5%BSA封闭1 h，anti-P-gp仓鼠单抗（一抗）孵育过夜，TBST洗涤3次，辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG（二抗）孵育1 h，TBST洗涤3次，使用ECL试剂盒至PVDF膜上显出清晰的条带，用ChemiScope Mini系统成像。
　　2.7 统计分析 统计用GraphPad 5.0 统计学软件处理，用±s表示，组间差异采用t检验。
　　3 结果
　　3.1 四物汤水煎液安全浓度的考察 四物汤水煎液在相当于含生药质量浓度为0.625～10 g·L-1相对存活率大于90%，表明药液在0.625～10 g·L-1为安全浓度，见图1，所以受试药液质量浓度在0.625～10 g·L-1考虑。
　　3.2 对Caco-2细胞MDR1基因的影响 本实验考查了3个不同时间点四物汤水煎液对MDR1基因的影响，与对照组比较，3个时间点中维拉帕米和利福平阳性对照组具有统计学意义（P<0.05），表明重复实验具有可靠性；与空白对照组比较，3个时间点中各浓度四物汤水煎液组对P-gp mRNA具有不同程度的上调作用，表明四物汤水煎液在mRNA水平对P-gp具有诱导作用，其中在给药48 h实验结果较为稳定，且不同浓度的四物汤水煎液都有统计学意义，下步实验将选择四物汤水煎液作用Caco-2细胞48 h分别考查其对P-gp功能活性和蛋白表达水平的影响，见图2。
　　3.3 对Caco-2细胞P-gp外排功能的影响 与对照组相比，四物汤水煎液3.3，5.0，10.0 g·L-1作用于Caco-2细胞1 h后，胞内罗丹明123的荧光强度影响不大，无统计学意义，表明四物汤水煎液在短时间内对Caco-2细胞P-gp的功能活性没有影响；3个不同浓度的四物汤水煎液作用于Caco-2细胞48 h后，细胞内罗丹明123的荧光强度分别减弱了16.6%，22.1%（P<0.05），45.4%（P<0.01），表明四物汤水煎液对Caco-2细胞P-gp具有诱导作用，见图3。
　　3.4 对Caco-2细胞P-gp蛋白表达的影响 用Western blot分析P-gp蛋白表达，与对照组相比，P-gp抑制剂维拉帕米显著降低P-gp蛋白表达，利福平显著诱导了P-gp蛋白表达，四物汤水煎液对P-gp蛋白有显著诱导效应，见图4。综合之前的罗丹明123外排和MDR1基因表达结果，表明四物汤水煎液能够通过诱导MDR1基因的表达来增加P-gp蛋白表达，进而增强P-gp的功能。
　　4 讨论
　　本实验室前期从全方、有效部分、有效成分3个化学层次和整体、器官、细胞及分子4个药理水平，基本阐明了补血名方四物汤的药效物质基础，并重构了基于有效成分的新组方，首次发现了果糖和芍药苷的补血活性[12-14]，本文深入到药物代谢动力学领域，初步探讨四物汤可能对机体产生的效应。选择公认的P-gp的阳性抑制剂维拉帕米组，同时设置P-gp的阳性诱导剂利福平组[15]，并通过Q-PCR筛选可靠稳定的时间点，考查了四物汤水煎液对P-gp的功能和表达影响。