四物汤对Caco—2细胞P—糖蛋白功能和表达的影响

　　[摘要] 研究四物汤对Caco-2细胞P-糖蛋白（P-gp）功能和表达的影响。采用实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR）分析Caco-2细胞上MDR1基因mRNA的表达量；采用流式细胞仪检测经四物汤水煎液处理后Caco-2细胞对罗丹明123摄取量的影响，以评价P-gp的外排功能；采用Western blotting法检测四物汤水煎液对Caco-2细胞P-gp蛋白表达量的影响。与空白对照组比较，四物汤水煎液3.3，5.0，10.0 g·L-1孵育Caco-2细胞24，48，72 h对MDR1基因mRNA的表达量具有上调作用，表明四物汤水煎液对MDR1具有诱导作用；四物汤水煎液作用于Caco-2细胞48 h后，细胞内罗丹明123的摄取量分别减弱了16.6%，22.1%（P<0.05），45.4%（P<0.01），提示长期应用四物汤水煎液，可增强Caco-2细胞P-gp的外排功能；四物汤水煎液孵育Caco-2细胞48 h后，上调了Caco-2细胞膜上P-gp蛋白表达量，表明四物汤水煎液对P-gp的蛋白表达量具有诱导作用。
　　[关键词] 四物汤；P-gp；MDR1；Caco-2细胞；罗丹明123
　　[Abstract] To study the effect of Siwu decoction on the function and expression of P-glycoprotein （P-gp） in Caco-2 cells. The Real-time quantitative poly-merase chain reaction （Q-PCR） was used to analyze the mRNA expression of MDR1 gene in Caco-2 cells. Flow cytometer was used to study the effect of Siwu decoction on the uptake of Rhodamine 123 in Caco-2 cells， in order to evaluate the efflux function of P-gp. Western blotting method was used to detect the effect of Siwu decoction on the P-gp protein expression of Caco-2 cells. Compared with the blank control group， after Caco-2 incubation with Siwu decoction at concentrations of 3.3， 5.0， 10.0 g·L-1 for 24， 48， 72 h， the mRNA expression of MDR1 was up-regulated， suggesting the effect of Siwu decoction in inducing the expression of MDR1. After the administration with Siwu decoction in Caco-2 cells for 48 h， the uptake of Rhodamine 123 in Caco-2 cells decreased by respectively 16.6%， 22.1%（P<0.05） and 45.4%（P<0.01）， indicating that the long-term administration of Siwu decoction can enhance the P-gp efflux function of Caco-2 cells. After the incubation of Caco-2 cells with Siwu decoction for 48 h， the P-gp protein expression on Caco-2 cell emebranes， demonstrating the effect of Siwu decoction in inducing the protein expression of P-gp.
　　[Key words] Siwu decoction； P-gp； MDR1； Caco-2； Rhodamin 123
　　P-糖蛋白（p-glycoprotein，P-gp） 是一个由约1 280个氨基酸组成的能量（ATP）依赖性转运蛋白，分布在人体很多正常组织中，如肠道、肝、肾以及血脑屏障胎盘屏障的上皮细胞，它能将P-gp底物药物逆向转运出细胞，降低药物在细胞内的浓度，减少药物对细胞组织的损伤，此外，肠黏膜P-gp能够将底物药物由肠上皮细胞逆转运药物到肠腔中从而降低了药物在肠道的吸收，影响药物的口服生物利用度[1-2]。
　　四物汤首见于宋代《太平惠民和剂局方》，由熟地黄、当归、白芍、川芎组成，为经典的补血之基础方，由四物汤衍生的桃红四物汤[3]、人参四物汤[4]和参芪四物汤[5]等，在现在临床上发挥着重要的作用；现代研究表明，四物汤在免疫、血液、心血管、抗放和对抗化学药物的毒性都有很好的调节作用[6]。根据文献报道，P-gp抑制剂能够改善芍药苷的体外吸收[7]；川芎嗪受到P-gp的外排作用，并对P-gp的表达有抑制作用[8-9]，阿魏酸对P-gp具有诱导作用[10]等。上述化合物在四物汤中为治疗血虚证的重要活性化合物，同时它们都受到P-gp的调节作用，并作为一个整体被吸收、代谢、分布、发挥疗效；查阅文献发现四物汤在转运体中发挥的作用并没有相关报道，本实验立足四物汤对P-gp转运体功能和表达的影响，采用人类结肠癌细胞系Caco-2细胞模型，研究了四物汤对P-gp的综合调节作用，为四物汤及其衍生方的临床应用提供参考依据。
　　1 材料
　　1.1 细胞 Caco-2细胞购买于中国协和医科大学基础医学细胞中心，实验室用的细胞代数为40～60代。
　　1.2 试剂与药品 MEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素、非必须氨基酸（NEAA）（Hyclone）；0.25%胰蛋白酶-EDTA、L-谷氨酰胺、罗丹明-123（Sigma公司）；MTS试剂盒（Promega公司）；四物汤由熟地黄、当归、白芍、川芎组成，全部药物均购自安徽亳州同仁堂中药厂（由军事医学科学院二所九室马百平研究员鉴定）；盐酸普萘洛尔、利福平（中国食品药品检定研究院）；MDR1，GAPDH引物（Invitrogen公司）；P-gp单抗（Thermo公司）；HRP标记山羊抗鼠lgG （康为世纪有限公司）；QPCR试剂盒（ABI）。
　　1.3 仪器 流式细胞仪（美国Becton-Dickinson FACS caliber 公司）；Western blotting电泳仪、湿转膜仪（美国Bio-Rad公司）；PVDF膜（美国Millpore公司）；StepOnePlus Real-time PCR系统（Applied Biosystems）；CO2培养箱（SANYO MCO20-AIC）；ChemiScope Mini化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。
　　2 方法
　　2.1 供试样品的制备 四物汤水煎液按《太平惠民和剂局方》规定的剂量称取组成，熟地黄15 g，当归10 g，白芍10 g，川芎6 g，共计41 g。加入适量的蒸馏水，浸泡1 h，按1∶8倍体积比加入蒸馏水，水煎微沸1 h，6层纱布过滤，药渣再加入5倍体积的蒸馏水，水煎微沸30 min，过滤，合并2次滤液，抽滤后旋转蒸发浓缩成100%药液（即每1 mL药液含生药1 g）。
　　2.2 细胞培养 Caco-2细胞复苏后以2×105 个/mL密度接种于25 cm2的细胞培养瓶中，加入5 mL含10%FBS，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，0.1 U·L-1青霉素-链霉素双抗的不完全MEM培养基。细胞在37 ℃，5%CO2的培养箱中培养，隔天换液，待细胞生长至80%～90%时用0.25%胰酶消化并传代，选取对数生长期的Caco-2细胞用于实验。