柚皮苷对破骨细胞分化的影响(2)

　　2方法
　　2.1薄骨片制备沿牛股骨长轴切取牛皮质骨骨片（厚约100μm），用细砂纸将骨片打磨平滑，修剪成0.5cm×0.5cm大小，紫外线正反面照射过夜，75%乙醇浸泡30min，D-hank′s液洗3遍，放入含培养基的小瓶中，封口，置于4℃保存备用，用时取出晾干。
　　2.2破骨细胞诱导与鉴定将RAW264.7单核细胞株接种于6孔板中的预置无菌玻片和薄骨片上，细胞接种密度2×104个/cm2，4h待细胞贴壁后，换为含10%FBS的高糖DMEM培养基（含100μg·L-1RANKL），37℃，5%CO2的培养箱中培养，每2d换液1次。诱导5d后倒置相差显微镜观察细胞的形态特征。TRAP染色：将玻片取出，用柠檬酸盐/丙酮溶液固定30s，在以萘酚AS-BI磷酸盐作为底物的孵育液中37℃孵育1h，蒸馏水洗3次，苏木精复染2min，干燥后二甲苯透明，封固后光镜观察;骨吸收陷窝：胰蛋白酶和EDTA将薄骨片上的破骨细胞消化，2.5%的戊二醛固定30min，PBS超声清洗3次（5min/次），30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，CO2临界点干燥，喷金后扫描电镜观察骨吸收陷窝。
　　2.3MTT法筛选柚皮苷抑制破骨细胞最佳浓度采用MMT法测定不同浓度柚皮苷（500，100，50，20，10，1μg·L-1）对破骨细胞的抑制作用。破骨细胞在加入含柚皮苷的培养基中培养48h后，用MTT试验检测柚皮苷对破骨细胞的抑制作用，利用酶标仪，在570nm波长处测定吸光度A。结果显示柚皮苷在20μg·L-1抑制作用最强，见图1。根据以上的筛选结果采用20μg·L-1的柚皮苷进行以下实验研究。
　　与对照组相比1）P<0.05，2）P<0.01（图5同）。
　　2.4TRAP阳性细胞计数与骨吸收面积分析实验分为对照组和柚皮苷组（20μg·L-1），按照上述诱导方法，柚皮苷组采用含有20μg·L-1柚皮苷的诱导剂进行诱导，5d后取出玻片，进行TRAP染色（方法同上）。计数标准：2组分别在100倍视野下随机选取10个视野进行计数，取平均值;细胞呈现玫瑰红色或粉红色，细胞核≥3个，上述实验重复3次。骨吸收陷窝操作方法同上，2组各10张薄骨片，每张骨片随机选取10个区域，区域之间无重叠，采用ImageProPlus6.0图像分析软件对骨吸收面积进行分析。
　　2.5流式细胞术检测细胞增殖对照组与柚皮苷组诱导培养第5天后，胰酶消化法收集细胞，PBS离心清洗2次，弃上清，加入预冷（4℃）的70%乙醇1mL，吹打均匀，4℃固定8h，PBS清洗2次。以1mL含有0.2mgRNaseA的碘化丙啶/TritonX-100染色液重悬细胞，37℃染色15min。流式细胞仪检测细胞中DNA含量和细胞周期，计算S期细胞百分率与细胞增殖指数（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。
　　2.6荧光定量PCR检测相关基因表达细胞诱导培养5d后，收集细胞，加1mLTRIzol溶液，振荡混匀。采用相分离技术抽提取RNA，琼脂糖电泳法检测：RANK，TRAP，MMP-9，NFATc1与C-fos基因浓度及完整性。各组检测基因反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，引物由广州复能基因有限公司设计。基因引物序列：GAPDH正向引物5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反向引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，扩增片段为96bp;NFATc1正向引物5′-TCCAAAGTCATTTTCGTGGA-3′，反向引物5′-CTTTGCTTCCATCTCCCAGA-3′;c-Fos正向引物5′-CAGCCTTTCCTACTACCATTCC-3′，反向引物5′-ACAGATCTGCGCAAAAGTCC-3′;MMP-9正向引物5′-ACGACATAGACGGCATCCA-3′，反向引物5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3′;TRAP正向引物5′-AAATCACTCTTTAAGACCAG-3′，反向引物5′-TTATTGAATAGCAGTGACAG-3′;RANK正向引物5′-CCAGGGGACAACGGAATCA-3′，反向引物5′-GGCCGGTCCGTGTACTCATC-3′。逆转录反应体系、PCR扩增体系以及反应条件按照试剂盒说明书设定。反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析。基因表达量以检测基因的初始模板量以2-ΔΔCt表示。
　　2.7统计学分析所得数据采用SPSS16.0进行分析，计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　3结果
　　3.1破骨细胞鉴定RANKL诱导RAW264.7细胞株3d后开始有TRAP染色阳性的破骨细胞，诱导第5天后破骨细胞数量明显增多。TRAP阳性细胞呈玫瑰红色/红酒样，细胞核呈阴性，有多个细胞核;薄骨片可见骨纤维的连续性中断，出现骨陷窝，陷窝中可见残留的骨胶原纤维，见图2。
　　3.2TRAP阳性细胞计数与骨吸收面积分析
　　RANKL诱导5d后，进行TRAP染色。对照组破骨细胞数量比较多，且细胞核较多，TRAP（+）细胞数为（29.4±3.2）个;柚皮苷组破骨细胞数量少，细胞核较少，TRAP（+）细胞数为（19.6±2.4）个（P<0.05），见图3。对照组骨吸收陷窝数目较多，骨吸收总面积较大，为（3451.6±108.2）μm2;而柚皮苷组骨吸收数目少，总面积小，为（1972.4±96.4）μm2（P<0.05），见图4。
　　3.3对破骨细胞增殖的影响柚皮苷组细胞增殖指数（PI）为（21.74±2.57），低于对照组的（16.12±1.24），P<0.05。
　　3.4对破骨细胞分化过程相关基因的表达情况与对照组比较，柚皮苷可以明显的抑制TRAP特异性基因的表达（P<0.05）;对RANK基因表达无影响;对NFATc1基因有显著抑制作用（P<0.01）;而对C-fos基因有明显的促进作用（P<0.05）;对MMP-9特异性基因有一定的抑制作用（P<0.05），见图5。
　　4讨论
　　破骨细胞是来源于骨髓造血干细胞或骨髓远祖干细胞的终末分化的多核巨细胞，直接参与了骨重建的过程。在骨组织内，破骨细胞引起骨的破坏和吸收，是调节骨重建过程的重要细胞[4]。骨质疏松患者的破骨细胞常常处于活跃状态，骨吸收活性大于骨形成，导致骨量的丢失，骨结构的破坏。因此，抑制活跃的破骨细胞是防治骨质疏松的重要途径之一。