慢性HBV携带者肝组织PD—1表达的临床意义(2)

　　1.5 病理学检查

　　肝穿刺获得的肝脏条索组织用10%中性甲醛固定，之后依次石蜡包埋、切片，行HE染色；由温州医科大学附属二院病理科2名专家阅片，病理诊断标准参照《慢性乙型肝炎防治指南》[6]，评定标本的炎症分级（G）和纤维化分级（S）。根据病理炎症结果将50例病例分为两组：A组：炎症G0；B组：炎症≥G1。

　　1.6 免疫组化检测肝脏组织PD-1表达

　　石蜡切片脱蜡、水化，3%双氧水孵育，双蒸水冲洗，PBS浸泡，枸橼酸缓冲液中微波修复，PBS冲洗，血清封闭，室温孵育后倾去血清，滴加PD-1一抗工作液，37℃孵育，PBS冲洗后滴加二抗工作液，37℃孵育，PBS冲洗，滴加辣根酶标记SP工作液，37℃孵育，PBS冲洗，之后DAB显色剂显色，苏木素复染。梯度酒精脱水、透明、封片。用图像分析软件Image-Pro Plus6.0重复3次读取每张片的阳性区域的吸光度值，取平均值作为蛋白的相对含量。

　　1.7 统计学分析

　　采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析，计量资料组间比较t检验；相关性分析使用非参数检验Spearman（斯伯曼/斯皮尔曼）法分析；P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1血清标志物和病毒学指标

　　50例患者肝功能在正常范围，ALT（31.20±11.81）U/L，均为HBeAg（+），HBV DNA：10^5～10^8拷贝/mL。病理学结果见表1。并根据炎症结果分为两组：A组26例（炎症G0）和B组24例（炎症≥G1）。A组病例中S2分级的6例，B组病理中S2分级的6例，S3分级的有3例，病理分级炎症≥G2或纤维化≥S2的例数为15例。

　　2.2 血清肝纤维化指标检测结果

　　A组和B组患者4种血清肝纤维化指标水平均无统计学差异（见表2）。

　　2.3 免疫组化检测肝脏组织PD-1表达结果

　　A组患者肝脏组织PD-1平均光密度值为（1.56±0.39），B组为（2.87±0.62）。B组患者肝脏组织PD-1表达水平明显高于A组（t=9.05，P<0.05）。50例患者纤维化S0级（11例）PD-1平均光密度值为（1.86±0.52），纤维化S1级（24例）PD-1平均光密度值为（2.07±0.69），纤维化S2级（12例）PD-1平均光密度值为（2.58±0.65），纤维化S3级（3例）PD-1平均光密度值为（2.82±0.15）。

　　2.4 PD-1与肝纤维化相关性分析

　　PD-1表达与肝纤维化分级呈正相关，相关系数rs=0.356，P=0.011<0.05。PD-1表达与肝脏炎症分级呈正相关，相关系数为rs=0.780，P=0.000<0.05。

　　3 讨论

　　乙肝病毒感染是我国最常见的肝脏感染性疾病，据统计慢性HBV感染者约9300万人，而其中慢性HBV携带者占了很大的比重[6]。慢性HBV携带者，经各项检查如肝功能以及CT、B超等影像学检查往往无明显异常的发现。但是，近年来愈来愈多的研究提示，乙肝进展具有“隐蔽性”，许多ALT正常的慢性HBV感染患者，同样存在肝损害，部分患者病变程度在G2、S2以上，甚至进展到早期肝硬化阶段[7，8]。本研究中也同样存在这样的情况，50例患者虽肝功能均正常范围，影像学亦无明显异常，但病理分级炎症≥G2或纤维化≥S2的例数为15例。