ERK1/2参与IL—33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程(2)

　　1.2.3 RT-PCR检测标记性基因 α-SMA及信号通路关键因子TRAF-6的mRNA表达变化 取对数期生长细胞，消化后调整密度至5×105/mL 接种于培养瓶。无血清培养基同步化饥饿12 h，再以10 ng/mL IL-33诱导24 h，其中检测α-SMA时用40μM PD98059预处理60 min，RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录成cDNA。α-SMA上游引物：5'- ACTCTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3'，下游引物：5'-CTTCGTCGTATTCCTGTTTGCT-3'；TRAF-6上游引物：5'- TCTCCCCTGCCTTCATTGTT-3'，下游引物：5'-AGGCTGGCGAT-TTTGTGTTT-3'；β-actin上游引5'-ACGGTCACAG-GTCATCACTATCG-3'，下游引物：5'- GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3'。扩增条件：95℃预变性2 min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察扫描并进行电泳条带分析，以目的条带与β-actin条带的比值作为目的条带的相对值。各组实验均重复3次。

　　1.2.4 Western blot检测α-SMA、TRAF-6、ERK1/2 和p-ERK1/2蛋白表达 细胞以10 ng/mL IL-33诱导24 h，其中检测α-SMA时用40μM PD98059预处理60 min，收集细胞，预冷PBS洗涤2次，加入200 μL RIPA裂解液（每1 mL裂解液中加10 μL PMSF），冰上裂解30 min，超声，4℃、12000 rpm离心10 min，取上清。Bradford法测定蛋白含量。4∶1体积比加入上样缓冲液，100℃ 5 min变性。每孔上样等量总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。30v转膜150 min，含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h。TBST洗膜3次，分别加入一抗α-SMA（1∶1000稀释）、TRAF-6、ERK1/2和p-ERK1/2（1∶400稀释），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入对应二抗（1∶500稀释），室温孵育1 h。最后BCIP/NBT显色液暗处显色观察，凝胶成像系统扫描分析，磷酸化水平用磷酸化蛋白和总蛋白的相对值表示，目的蛋白水平用目的蛋白和内参蛋白的相对值表示。各组实验均重复3次。

　　1.3 统计学分析

　　数据采用SPSS 13.0 统计学软件进行，所有实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 IL-33对心脏成纤维细胞增殖的影响

　　加入10 ng/mL IL-33刺激细胞培养24、48、72 h 后，各组细胞生长状态良好，随着培养时间的延长，细胞数量不断增多。MTT结果显示，与未刺激组比较，IL-33明显诱导细胞增殖（P<0.05），见表1。

　　2.2 IL-33对TRAF-6 mRNA和蛋白水平的影响

　　与对照组相比，TRAF-6 mRNA和蛋白水平均明显上升（P<0.05），见图1和表2。表明IL-33诱导心脏成纤维细胞时，活化其下游信号。

　　2.3 IL-33对p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达的影响

　　Western- blot 结果显示，IL- 33刺激心脏成纤维细胞后ERK1/2总蛋白无明显变化，而p-ERK1/2蛋白表达明显升高，与对照组比较，有显著性差异（P<0.05），见图1和表2。表明IL-33/ST2-TRAF-6 信号通路激活后，引起下游ERK1/2通路的参与。

　　2.4 IL-33对α-SMA mRNA和蛋白水平的影响

　　α-SMA是肌成纤维细胞的标记性蛋白。我们结果显示，IL- 33刺激成纤维细胞24 h后，α-SMA mRNA和蛋白表达明显上调（P<0.05）；40 μM PD98059预处理60 min后，α-SMA水平较单纯刺激组显著减弱，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1和表3。表明IL-33诱导了心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，这一过程可以被ERK1/2特异性阻断剂所抑制。

　　3 讨论

　　心力衰竭是各种危重心血管疾病的终末阶段，由于心肌损伤，引起心肌间质纤维化、心肌肥大和心功能不良，限制心肌细胞活动，降低心室顺应性，影响心肌的收缩和舒张功能，导致心脏重构[6，7]。在慢性炎症过程中，有多种炎症细胞参与，并释放多种炎症因子，导致肌成纤维细胞的形成并大量分泌ECM，最终导致纤维化[2，8-9]。因此确切认识心肌纤维化发生机制，有针对性地采取措施，进而有效预防和逆转心肌纤维化，对心衰的早期治疗也有着重要意义。