规模化牛场致病性大肠杆菌的分离与鉴定(2)

　　1.2.5 麦康凯培养基 取蛋白胨2.0 g、氯化钠0.5 g、乳糖1.0 g、胆盐0.5 g和100 mL蒸馏水，调整pH为7.4，加入2.5g琼脂，分装于锥形瓶中，121 ℃灭菌15 min，待冷至50 ℃左右时，加入灭菌的1%中性红水溶液0.5 mL，摇匀后倾入培养皿，完全冷却后4 ℃保存备用。

　　1.2.6三糖铁培养基 取适量三糖铁琼脂粉，加入100 mL蒸馏水，加热溶解，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷至50 ℃左右时分装试管，使成底层较深的斜面。

　　1.3 试剂

　　微量生化鉴定管为杭州微生物试剂有限公司产品，购自武汉市某商业公司。

　　1.4 试验动物

　　8～10 g SPF昆明鼠，购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心。

　　1.5 细菌的分离培养与鉴定

　　采用需氧和厌氧（缸内燃烛法）两种方法，利用普通琼脂培养基从病料中分离细菌。对不同形态的菌落进行涂片、染色、镜检和纯培养。将纯培养菌接种于5%血液营养琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、三糖铁培养基、麦康凯培养基，37 ℃培养24 h，观察细菌培养特性。

　　1.6 分离菌生化试验

　　取生长良好的红色菌落接种于营养肉汤，37 ℃培养 24 h，按常规方法进行生化试验，主要包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖的发酵试验，硫化氢、丙二酸盐利用、枸橼酸盐利用、鸟氨酸盐脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖磷酸盐、卫茅醇试验等。

　　1.7 动物试验

　　将细菌纯培养物接种于普通肉汤中培养24h，分别以口腔和腹腔途径各接种5只SPF昆明小鼠，每只接种0.2 mL（约含108 CFU/mL）菌液，另取2只作为对照，隔离饲养观察。

　　2 结果与分析

　　2.1 分离菌的形态

　　自患牛腹泻物中分离获得纯化菌株1株。该分离菌为兼性厌氧菌，在普通营养琼脂培养基上就可以生长，显微镜下可以见到菌体短小，两端钝圆、着色较深， 无芽孢，多呈单个排列， 个别形成短链状排列，革兰氏染色阴性（图1）。

　　2.2 分离菌培养特性

　　分离菌在普通琼脂培养基上生长良好，为中等大小、边缘整齐、光滑湿润、有圆形隆起的菌落。最适生长温度为 37 ℃，最适生长 pH 为 7.2～7.4。分离菌在麦康凯琼脂培养基上形成光滑的红色菌落；在伊红美蓝琼脂培养基上产生黑色，具有金属光泽的小菌落；发表文章在 ss 琼脂培养基上一般不生长或生长较差，菌落明显比前两种的小；在三糖铁琼脂斜面培养基上形成黄色斜面，黄色底层并有少量气泡产生；在血液琼脂培养基上 37 ℃培养 24 h 后可以形成灰色菌落，菌落表面光滑、边缘整齐，菌落周围有明显的 α、β溶血环。

　　2.3 分离菌生化试验结果

　　分离菌株的生理生化特性见表1。分离菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，不发酵蔗糖、卫茅醇，液化明胶，葡萄糖磷酸、硫化氢、枸橼酸盐、丙二酸盐试验阴性；鸟氨酸盐脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脱氨酶试验阳性。

　　注：“+”表示为阳性；“-”表示为阴性。