基于MI—RI大鼠心肌细胞代谢组学研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制(2)
2.7 四逆汤（缺甘草与否）对MI-RI心肌细胞代谢组学研究
2.7.1 细胞培养液样品前处理方法 取细胞培养液样品于室温解冻，精密吸取100 μL，加甲醇800 μL，涡旋混合1 min；离心15 min（转速1.2×104 r ·min-1），取上层萃取液300 μL于氮气吹干设备中低温（30 ℃）吹干，残渣加75 μL甲氧胺吡啶溶液（甲氧胺浓度15 g·L-1），涡旋混合2 min，于70 ℃烘箱中肟化1 h；加75 μL衍生化试剂MSTFA（含1%TMCS）涡旋混合2 min，室温静置1 h；加1 mL 正庚烷（含内标白术内酯Ⅱ 0.032 8 g·L-1），涡旋混合 30 s；离心10 min（转速4.0×103 r·min-1），取上清 300 μL 至GC 进样瓶，即得。
2.7.2 GC-MS 分析条件 HP-5MS 毛细管柱（250 mm×30 m，0.25 μm，Angilent），载气为高纯氦气，流速1 mL·min-1；进样量1.0 μL，不分流进样；进样口260 ℃；离子源（EI）230 ℃；四极杆150 ℃；电离电压70 eV；He 扫气流量10 mL·min-1；扫描方式：全扫描模式，m/z 30～600。升温程序（初始温度70 ℃，保持4 min；以每分钟 6 ℃升温至115 ℃；再以每分钟 4 ℃升温至126 ℃；以每分钟 6 ℃升温至190 ℃；以每分钟 1 ℃升温至194 ℃，保持2 min；最后以每分钟 3 ℃升温至280 ℃）。
2.7.3 统计分析 实验所得GC-MS 图谱数据通过XCMS-online（http：//metlin.scripps.edu/download/）工具箱进行峰校正、峰对齐和峰积分等预处理后，采用Matlab软件对数据进行归一化处理，为避免误差，采用内标（白术内酯Ⅱ）作为参比。数据预处理后的3 个数据集（空白对照组A +模型组B、模型组B+四逆汤组C、模型组B+ 缺甘草四逆汤组D）分别导入多维分析软件（SIMCA-P 13.0，Sweden）中，进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），经模式识别与特征代谢物的提取，得到引起2组间差异的主要潜在代谢标志物所对应的保留时间和m/z ，经NIST 08 质谱库检索、AMDIS 鉴定、文献对照和标准品比对等方法，对潜在生物标志进行指认。对17 个潜在代谢标志物的相对含量，采用Minitab V15.0（State College，USA）软件进行One-Way ANOVA （置信区间95%）检验，见表2，图2。
17 个潜在代谢标志物中，四逆汤组与缺甘草四逆汤组的潜在代谢标志物有明显的区别，仅四逆汤组回调的潜在代谢标志物：尿素、甘氨酸、硬脂酸和未知成分2；仅缺甘草四逆汤组回调的潜在代谢标志物：亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和脯氨酸；二者共同回调的潜在代谢标志物：乳酸、未知成分1、缬氨酸、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、果糖、葡萄糖、甘露糖和棕榈酸。
3 结论与讨论
本研究采用体外心肌细胞试验，通过测定LDH与CK活性，二者是评价心肌缺血程度的客观指标，也是判断MI-RI心肌细胞不可逆的重要指标。结果表明四逆汤与缺甘草四逆汤对MI-RI 模型对H9c2心肌细胞造成的损伤均具有明显的保护作用，且前者保护作用更加显著。四逆汤对H9c2心肌细胞损伤的保护作用更强，一个重要原因是四逆汤能通过调节LDH，CK等指标的水平及减少MI-RI所致的心肌细胞的凋亡可挽救更多的心肌的作用，起到缓解心肌细胞坏死的发生，提高MI-RI 的治疗效果 [10]。
通过对代谢组学数据进行统计分析，17个潜在代谢标志物中，乳酸盐、果糖、葡萄糖、甘露糖和3-磷酸甘油与糖酵解途径相关，这表明四逆汤（缺甘草与否）对缺血再灌注损伤H9c2心肌细胞的保护作用是通过调节与糖酵解的途径来实现的。
MI-RI模型损伤，因为H9c2心肌细胞缺血缺氧使有氧代谢发生障碍，能量供应以糖酵解为主，通过糖酵解生成乳酸；同时，H9c2心肌细胞模型组的LDH 活性显著升高，也表明乳酸含量升高的必然性。这一点与之前心肌细胞损伤的病理生理变化的研究结果相吻合[11]。葡萄糖和甘露糖含量显著降低是因为造模后的心肌细胞在缺血缺氧的环境下，完全通过糖酵解来获得能量所致[12]；果糖的含量稍有升高，可能是在复氧的情况下，恢复葡萄糖的有氧代谢，使部分葡萄糖转化为果糖，而心肌细胞无法完成果糖的糖异生过程所致[13]。MI-RI模型组中3-磷酸甘油的含量显著升高，可能因为在缺血缺氧条件下果糖与甘露糖等己糖转化为3-磷酸甘油酸所致[12]。棕榈酸与硬脂酸2种不饱和脂肪酸的含量显著降低，可能因为在缺血缺氧条件下，葡萄糖的无氧酵解使葡萄糖仅在有氧氧化生成乙酰CoA的含量降低，从而致使以乙酰CoA为合成原料的棕榈酸与硬脂酸的含量显著下调[12]。缬氨酸与异亮氨酸属支链氨基酸，作为心肌缺血时心脏可供选择的重要能量底物[13]，心肌细胞在缺血缺氧情况下，利用支链氨基酸作为代偿性的能量供给，致使二者在MI-RI模型组中的含量显著降低。亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸和脯氨酸的含量水平显著降低，这些α-氨基酸作为能量代谢的重要前体及能转化为一些生物分子[12]，其相对含量的变化可能与心肌细胞在MI-RI过程中对能量的需求而应激调节的结果。尿素的含量显著升高，可能与上述几种氨基酸的代谢使尿素的含量有所积蓄有关[12]。
与MI-RI 模型组相比，四逆汤组和缺甘草四逆汤组除甘露糖外，分别将乳酸等12种代谢物的含量进行了不同程度的回调。从相对含量分析四逆汤组和缺甘草四逆汤组间的差异主要表现如下。
乳酸、谷氨酰胺与葡萄糖的含量在附子的3 种双酯型生物碱的毒性代谢组学分析结果[14]是血浆中乳酸盐的水平升高，葡萄糖和谷氨酰胺的含量下降；缺甘草四逆汤组中乳酸和谷氨酰胺的回调幅度较四逆汤组回调的幅度明显减小，而葡萄糖的回调幅度则过大，甚至超过了空白对照组的含量水平。3 种双酯型生物碱分别对血浆中葡萄糖含量的影响有高有低不尽相同，本研究结果可能是由于四逆汤缺甘草方中复杂成分总体的调节作用使葡萄糖含量水平显著升高。以上均表明四逆汤中甘草解附子之毒通过调节糖酵解途径而实现的。
除乳酸、未知成分1、缬氨酸、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、果糖、葡萄糖和棕榈酸等代谢物的含量为四逆汤组与缺甘草四逆汤组共同回调外，前者回调了尿素、甘氨酸、硬脂酸和未知成分2的含量水平，后者回调了亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和脯氨酸的含量水平。根据以上潜在代谢标志物与生物代谢途径的关系可知，四逆汤中甘草解附子之毒是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中的氮的代谢途径得以实现的；缺甘草四逆汤组主要通过调节糖酵解、脂质代谢和α-氨基酸的代谢途径发挥保护MI-RI模型对心肌细胞的损伤，尤其是缬氨酸等α-氨基酸作为能量代谢的重要前体和能转化为一些生物分子，其含量变化可能因为缺甘草四逆汤中干姜与君药附子协同发挥辛热而助阳之功，或此应激使α-氨基酸的代谢重构以满足心肌细胞的能量需求有关。
未知成分1和未知成分2在各组中含量水平变化都较显著，但因前者在NIST08数据库中检索匹配度都很低，难以定性；后者保留时间靠后，与溶剂、保护气等杂质峰混在一起，亦难以对其进行定性识别。
综上所述，本研究采用基于GC-MS 技术的代谢组学方法研究了四逆汤（缺甘草与否）对体外MI-RI模型对H9c2 心肌细胞的保护作用，结果显示四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中的氮的代谢等生物代谢途径实现解毒增效之功。为进一步阐释四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制，对在体血浆进行代谢组学技术结合血清化学指纹图谱研究还在进一步研究中。
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