[摘要] 四逆汤是经典《伤寒论》中的急救方，由附子、甘草（炙）、干姜组成，研究建立体外H9c2心肌细胞MI-RI模型，通过观察正常对照组、MI-RI模型组、四逆汤作用组和缺甘草四逆汤作用组细胞的形态学特征，测定各组细胞的存活率、LGH和CK活性。同时收集各组细胞培养液并采用GC-MS 技术进行检测，对采集数据进行多元统计分析（PCA，PLS-DA，OPLS-DA），得到17个代谢标志物（指认15个），并对其相对含量及代谢途径进行分析。研究结果显示四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中氮的代谢等生物代谢途径得以实现的。研究也证明四逆汤与缺甘草四逆汤对MI-RI模型损伤H9c2心肌细胞均具有明显的保护作用，且四逆汤组保护作用更加显著。
[关键词] 四逆汤；代谢组学；H9c2 心肌细胞；MI-RI；附子配伍甘草；解毒增效
四逆汤由附子、甘草（炙）、干姜组成[1]，用于治疗心肌梗死、心力衰竭等诸多急症[2]。现代临床实践和药理学研究表明，四逆汤对心肌缺血-再灌注损伤（MI-RI）的心肌细胞具有明显的保护作用，可以影响其代谢、形态及功能等[2-4]。四逆汤中君药附子具回阳救逆之功，但燥热峻猛毒烈，配伍甘草，以“制其偏性，解毒存性”[5]。目前对附子配伍甘草解毒增效机制进行了大量而有价值的研究[6-7]，但从生物体对四逆汤复方多成分之整体反应的角度阐释该机制的研究尚薄弱。本实验采用H9c2 心肌细胞，建立体外MI-RI 模型，研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制，并采用GC-MS 联用技术对细胞培养液进行代谢组学研究，进而从代谢组学角度探讨四逆汤中附子配伍甘草的解毒增效机制。
1 材料
1.1 仪器
气相色谱-质谱联用仪（7890A GC-5975 MSD，Agilent）、CO2培养箱（Thermo Electron Corporation）；立式高压蒸汽高压灭菌器（MLS-3020，SANYO）；双人双面超净工作台（SW-CJ-2F）；通用离心机（Heraeus Megafuge 1.0R，Thermo）；酶标仪（PC plus 384）；透射电镜（H-600 IV Hitachi）；倒置显微镜（CK40，OLYMPUS）；氮气吹干仪（BF 2000- 15A）；微型旋涡混合器（WH-3）。
1.2 试药
DMEM 高糖培养基，0.25%胰蛋白酶溶液（HyClone）；胎牛血清FBS（兰州民海生物工程有限公司）；DMSO（成都科龙化工试剂厂）；MTT（Solarbio公司）；磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；链霉素（大连美罗制药厂）；青霉素（华北制药厂）；LDH，CK试剂盒（南京建成生物工程研究所）；乳酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、葡萄糖、果糖、甘露糖、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、棕榈酸、硬脂酸（上海安研商贸有限公司）；乙腈、甲醇（Fisher Chemicals 公司）；甲氧胺盐酸盐、MSTFA、正庚烷、TMCS、吡啶（Sigma-Aldrich 公司），实验用水均为超纯水（Milli-Q级），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 四逆汤和缺甘草四逆汤样品的制备[8-9]
四逆汤样品：取生附片30 g、炙甘草30 g和干姜20 g，置于圆底烧瓶中，加8倍量水浸泡0.5 h，回流提取，武火煮沸后文火保持微沸1.5 h，提取液趁热用纱布滤过；提取3 次，合并水提液，减压浓缩至适量，加去离子水定容至100 mL。
缺甘草四逆汤样品：取生附片48 g和干姜32 g，其他操作同上，即得缺甘草四逆汤样品溶液100 mL。
2.2 硫代硫酸钠“缺血”液的配置
取化学缺氧剂Na2S2O3溶于PBS 中，按试验中要求配制成各浓度“缺血”液，混匀，经0.22 μm滤器滤过，避光，临用现配。
2.3 含药血清及细胞培养基的制备
SD大鼠，清洁级，体重（200± 20） g，雌雄各半，实验动物生产许可证编号SCXK（川）2008-24，试验前12 h禁食不禁水。随机分为3 组（正常组、四逆汤组、缺甘草四逆汤组），每组8 只。
四逆汤组：灌胃四逆汤（预先温热），给药量为20 μL·g-1体重，每天1次，连续7 d。缺甘草四逆汤：灌胃缺甘草四逆汤（预先温热），其他同四逆汤组。正常组：于第7 天灌胃等量的生理盐水。末次给药后0.5 h，眼眶后静脉丛取血，静置1 h，离心（4 500 r ·min-1，10 min），分离血清，-70 ℃冷冻保存。
取含药血清和空白血清，室温解冻，56 ℃水浴灭活30 min，用DMEM 配制细胞培养液（含血清10%），经0.22 μm滤器滤过，除菌，临用现配。
2.4 细胞培养
H9c2大鼠心肌细胞株 （ATCC，CRL-1446，武汉博士德生物技术公司） 于含10%FBS的DMEM完全培养基（含青霉素100 U·mL-1、链霉素100 U·mL-1）中培养（培养箱条件为37 ℃，5%CO2）。贴壁生长后，2～3 d传代1次，按 1∶4传代。状态良好的取对数生长期细胞进行试验。
2.5 心肌细胞接种、分组及MI-RI模型的制备
调大鼠心肌细胞H9c2密度为 8×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔接种200 μL；调细胞密度为5×104个/mL，接种于6 孔培养板，每孔接种2 mL。培养2～3 d，待细胞覆盖率达到80%～ 90%时进行试验。
心肌细胞MI-RI模型的制备：更换正常细胞培养液为等量的“缺血液”，置CO2培养箱中孵育2 h，造成细胞缺血。再将“缺血液”换为正常细胞培养液，孵育24 h，对细胞造成再灌注损伤。
考察四逆汤及缺甘草四逆汤对心肌细胞MI-RI造模后损伤的作用及细胞培养液的分析，取心肌细胞随机分为4组，每组6复孔。试验分组如下：正常对照组，常规培养，细胞培养过程中不予任何干预；MI-RI模型组，造模后，加含10%空白血清的培养基；四逆汤组，造模后，加含10%四逆汤组大鼠血清的培养基；缺甘草四逆汤组，造模后，加含10%缺甘草四逆汤组大鼠血清的培养基。
MTT 法检测各组细胞存活率及生化指标，结果见表1。收集各组细胞培养液于-20 ℃密封保存待测。
2.6 四逆汤（缺甘草与否）对MI-RI心肌细胞的作用
2.6.1 心肌细胞形态学观察 心肌细胞接种于6孔培养板中分别经过上述各组所述方法处理后，于倒置显微镜下观察心肌细胞的形态和生活状况，并拍摄显微照片。
实验结果显示，加不同浓度Na2S2O3的PBS溶液作用后，与正常对照组的心肌细胞相比，模型组心肌细胞体积均有变小，且随着浓度的增加，形态损伤也随之加重，并出现细胞脱落现象；作用时间越长细胞损伤程度越明显；1.5 mmol·L-1组，作用2 h的心肌细胞损伤更加严重。
空白对照组：心肌细胞生长旺盛，细胞结构清晰。MI-RI模型组：心肌细胞开始变得粗糙，形态显不规则，细胞间隙增大，开始有细胞脱落的现象出现。四逆汤组：细胞可明显抑制再灌注对心肌细胞的损伤，表现为细胞形态虽稍有变小但仍很规则，间隙仍保持紧密，悬浮细胞明显减少。缺甘草四逆汤组：与四逆汤组相似，但部分细胞仍有损伤，见图1。
2.6.2 心肌细胞存活率测定 采用MTT比色法检测（边缘孔用空白培养基填充为空白对照组）。接种于96 孔培养板中的各组心肌细胞，进行相应处理后，每孔加MTT 溶液（5 g·L-1）20 μL，于孵箱中孵育 4 h，小心移弃培养液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，混合均匀，用酶标仪测定各孔吸光度A（检测波长为490 nm），计算细胞存活率，见表1。细胞存活率=试验组平均吸光度A/对照组平均吸光度A×100%。
2.6.3 生化指标的测定 分别各组心肌细胞上清培养液，分别按照LDH和CK试剂盒说明书进行检测。采用MATLAB（R2009a，The Math Works，Inc.）统计函数对实验结果进行处理，采用t检验判定各组与正常对照组数据间差异，见表1。结果显示，与正常H9c2 心肌细胞比较，模型组和缺甘草四逆汤组的心肌细胞存活率显著下降（P<0.01），LDH及CK活性显著升高（P<0.01）；四逆汤组心肌细胞存活率和CK 活性明显升高（P<0.05），LDH 活性显著升高（P<0.01）。与模型组比较，四逆汤组的存活率显著升高（P<0.01），缺甘草四逆汤组存活率明显升高（P<0.05）；四逆汤组和缺甘草四逆汤组的LDH 活性、CK 活性均显著降低（P<0.01）。缺甘草四逆汤组与四逆汤组相比，心肌细胞存活率显著升高（P<0.01），2组的LDH 活性相接近，CK 活性有明显差异（P<0.05）。说明四逆汤组及缺甘草四逆汤组可有效保护MI-RI 模型对H9c2心肌细胞的损伤，且四逆汤组保护作用更加显著。
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