[摘要] 前期研究认为酚酸类物质的积累可能导致地黄连作障碍。研究发现不同菌渣提取液对酚酸均具有降解效果，其中杏鲍菇菌渣提取液对5种酚酸（对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸）的总降解率最高，达75.3%。盆栽试验结果表明，施用杏鲍菇菌渣的地黄根际土壤中的对羟基苯甲酸和香草醛，相对含量最低。进一步研究表明施用杏鲍菇菌渣使地黄冠幅、叶片数量、叶长、叶宽和株高等指标接近头茬地黄水平，使重茬地黄块根质量鲜重和干重分别提高2.70，3.66倍，单株梓醇总量提高2.25倍，同时提高了地黄根际土壤中细菌、真菌和放线菌的数量，也提高了地黄根际土壤中蔗糖酶、纤维素酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性。这些结果表明，施用杏鲍菇菌渣一定程度上有效地缓解了地黄的连作障碍。
[关键词] 地黄；菌渣；酚酸；根际微生物；土壤酶活性；连作障碍
地黄Rehmannia glutinosa Libosch为玄参科多年生草本植物。怀地黄是我国著名的“四大怀药”之一，用药历史悠久，临床疗效确切，是构建我国现代大中药产业链重点研究利用的大宗药材之一，目前在河南省焦作地区（道地产区）种植面积已近1.5万hm2，产值达数十亿元。但地黄的生产中却存在严重的连作障碍问题，主要表现为：能正常出苗，但地上部分叶片生长较弱，枯黄萎蔫；地下部分多形成须根，不能正常膨大形成具有商品价值的块根；有效成分含量降低，品质下降；土传病虫害严重，植株多病；土壤物理性状变坏，养分失衡。每茬收获后须隔8～10年方可再植[1]。
目前认为，化感自毒作用是地黄连作障碍的主要原因之一[2-3]。引起连作障碍的化感物质众多，酚酸类物质是目前研究最多的一类化感物质[4]。酚酸类物质可以影响植物的膜系统、光合作用、酶活性以及内源激素，并可对植物生长产生抑制作用。其中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、香豆酸和阿魏酸是文献中经常报道的几种一元酚酸类化感物质[5-7]。本课题组前期研究结果发现土壤中部分酚酸含量与地黄生长状况呈显著负相关，即随着种植间隔年限的增加，酚酸含量降低，而地黄块根干重、体积和叶片干重增加，连作障碍现象减弱[8-9]。吴宗伟等亦发现种植地黄可以导致土壤中阿魏酸、香草酸、香草醛和对羟基苯甲酸的积累，同时这些酚酸可以强烈抑制水培地黄的生长，对其根长、根质量、全株鲜质量和株高均有阻碍作用[10]。据此，可推测出土壤中酚酸含量与地黄发生连作障碍关系密切。基于这种认识，本研究试图采用降低土壤中酚酸含量的策略来缓解地黄的连作障碍。
种植过食用菌的培养料俗称菌渣，属于农业废弃物，廉价易得，其中含有大量的营养成分以及漆酶等木质素降解酶类，可以降解多种酚酸物质[11-13]。故本实验拟通过采用食用菌菌渣降解地黄连作土壤中的酚酸类物质，来探索缓解地黄连作障碍的新技术。
1 材料与方法
1.1 供试材料与试剂 供试食用菌菌渣由河南省某食用菌研究所提供。实验供试土样（包括种植头茬地黄后土壤和邻近地块未种植过地黄的空白地土壤，分别称为重茬土和头茬土）均采自河南省温县农业科学研究所内地黄试验地。地黄供试品种为“温85-5”，“芦头”（块根繁殖材料）由温县农业科学研究所提供，经河南农业大学高致明教授鉴定为R. glutinosa。对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸均购自Sigma公司（美国）。甲醇为色谱纯（天津四友），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 菌渣提液对酚酸物质的降解 采用Li等[14]的方法研究菌渣提取液对酚酸类物质的降解，具体步骤：用250 mL磷酸缓冲液（pH 4.5，20 mmol·L-1）提取50 g新鲜菌渣（150 r·min-1，30 min），过滤后滤液离心（5 000 r·min-1，5 min），上清液即为菌渣提取液。在10 mL反应瓶中添加4.5 mL提取液和0.5 mL酚酸混合液（对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸质量浓度分别为10 mg·L-1），摇匀并培育24 h（30 ℃）。
取上述培养液的上清液1.5 mL过0.22 μm微孔滤膜后采用HPLC分析酚酸类物质含量[9]。色谱仪为Waters 2695 高效液相色谱仪，分离柱为Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，流动相组分为甲醇和水（流动相中超纯水用分析纯的冰醋酸调节至pH 2.8）81∶19，流速 0.6 mL·min-1。
1.3 盆栽试验 采用盆栽试验研究菌渣对土壤中酚酸类物质的降解以及对地黄生理生化指标的影响。试验分3个处理进行，头茬处理采用头茬土种植地黄；重茬处理采用重茬土种植地黄；菌渣处理在重茬土中添加10%菌渣并培育30 d（30 ℃）后种植地黄。试验在直径20 cm、高30 cm的陶瓷盆钵中进行，每盆装土11 kg，并按照常规方法栽培地黄种栽。每个处理设4个重复，每个重复6盆，每盆1株。每个重复随机选取长势一致的地黄3株，挂牌，分别在其种植后的40，70，100，130，160，180 d测定所种地黄植株的株高、叶长、叶宽、叶片数、冠幅及叶绿素含量；种植180 d后收获，测定块根质量和梓醇含量，以及根际土壤中酚酸含量。
1.4 土壤中酚酸含量分析 根据杜家方等[9]的方法分析土壤中酚酸含量，具体步骤为：土壤样品自然风干，破碎后过40目筛，称取土样125 g，加入蒸馏水250 mL充分搅拌，振荡后静置24 h，取上清液置于50 ℃旋转蒸发至近干，然后加高纯水定容至10 mL。过0.22 μm微孔滤膜后采用HPLC分析酚酸类物质含量，HPLC测定方法同上。
1.5 梓醇含量分析 根据王太霞等[15]的方法分析地黄块根中梓醇含量，具体步骤为：分别精确称取地黄块根粉末0.5 g于100 mL锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声提取30 min，静置后过滤，过0.22 μm微孔滤膜后用于HPLC分析。
1.6 地黄生理生态指标分析 按照常规方法测定地黄株高、叶长、叶宽、冠幅和叶片数。叶绿素含量分析方法[16]为：每个处理中选取4株地黄，用SPAD-502叶绿素仪分析地黄第5片叶叶绿素含量，选取5个部位分析叶绿素含量。
1.7 土壤微生物数量的测定 细菌、真菌、放线菌计数采用稀释涂抹平板法。细菌培养采用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用马丁孟加拉红培养基，放线菌采用淀粉硝酸钾培养基（高氏一号）。微生物数量以每克样品的菌数表示[17]。
1.8 土壤酶活性测定 采用比色法对脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、纤维素酶活性进行测定。过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法。脲酶采用苯酚钠比色法，蔗糖酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法、碱性磷酸酶用磷酸苯二钠比色法、纤维素酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法进行测定[18]。
2 结果
2.1 菌渣提取液对酚酸类物质的降解 通过比较不同菌渣提取液对5种酚酸（对羟基苯甲酸、丁香酸、香草酸、香草醛和阿魏酸）的降解效果发现（图1），杏鲍菇粗酶液对酚酸的降解率最高，达到75.3%，其次为白灵菇、平菇和姬菇，表明杏鲍菇菌渣具有对酚酸类物质的最大降解潜力，因此选其用于下一步盆栽试验。
2.2 菌渣对土壤中酚酸物质的降解 在土壤中未检出香草酸、丁香酸和阿魏酸，因此仅评价杏鲍菇菌渣对对羟基苯甲酸和香草醛的降解效果（图2），结果表明，菌渣使根际土壤中对羟基苯甲酸从0.358 6 mg·kg-1降低到0.027 1 mg·kg-1，降解率达到92.5%；香草醛的量从0.070 0 mg·kg-1降低到检测限以下，降解率达到100%，表明杏鲍菇菌渣有效的降解了土壤中的酚酸物质。
2.3 施用菌渣对地黄块根质量和梓醇含量的影响 施用菌渣对地黄块根质量和梓醇含量的影响较显著（图3，表1）。在3个处理中头茬地黄块根质量最高，重茬地黄块根质量最小，施用菌渣显著的提高了重茬地黄块根质量，其鲜重和干重分别是重茬地黄的2.70，3.66倍，但是仍低于头茬地黄水平。重茬处理地黄块根中梓醇含量最高，其次为菌渣处理，头茬处理含量最低。由于重茬地黄块根质量最小，因此单株梓醇总量反而最低，而头茬地黄由于具有最大的块根质量，梓醇总量达到最高，施用菌渣后地黄块根梓醇含量是重茬地黄的2.25倍，表明施用菌渣有助于提高单株地黄块根梓醇总量。
2.4 施用菌渣对地黄地上部生长及生理指标的影响 施用菌渣对地黄地上部生长及生理指标有明显影响（图4），重茬处理的地黄在整个生长期内叶片数量呈先增加后减少的趋势，而头茬和菌渣处理地黄叶片数则逐步增加，在同一时期内，头茬和菌渣处理地黄的叶片数均大于重茬处理，尤其在生长130 d以后，这种差异变得更为明显。3个处理地黄冠幅、株高、叶长和叶宽在整个生长期内均呈先增加后减少的趋势，其中在生长末期，头茬和菌渣处理的各指标均大于重茬处理。3个处理地黄叶片叶绿素含量在整个生长期内基本稳定，但在160 d头茬和菌渣处理叶绿素含量显著高于重茬处理。综合以上各个指标，施用菌渣可使重茬地黄地上部的生长及生理指标趋于正常化。
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