ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌

　　【摘要】目的：建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。方法：利用通用引物扩增真菌核糖体转录间隔区2（ITS2），对PCR产物进行测序，在GenBank中对测序结果进行Blastn等分析。结果：9株真菌测序结果与表型鉴定符合，鉴定出7株临床分离丝状真菌。结论：ITS2测序可以作为临床丝状真菌的分子生物学诊断方法之一。

　　【关键词】丝状真菌；内部转录间隔区；测序

　　【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1004—7484（2013）11—0043—02

　　随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8SrRNA基因和28SrRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。

　　1材料和方法

　　1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。

　　1.2临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。

　　1.3DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR）提取。具体步骤如下：①50μlLysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR于灭菌的EP管中。②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。③80℃热变性15分钟后，低速离心，取1～5μl裂解后的上清液作为PCR反应的模板。

　　1.4真菌ITS2序列扩增通用引物序列[3]ITS86-F：5'-gtgaatcatcgaatctttgaac-3'，ITS4-R：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，目的片段194bp～494bp。PCR反应总体积50μl，10×buffer5μl，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L，DNA模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25U，加入灭菌去离子水至50μl。反应条件为94℃预变性10min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。取PCR产物5μl，加1μl6×缓冲液上样，1.5%琼脂糖电泳，使用5μlDL1000分子量标准。

　　1.5PCR产物测序及序列分析将PCR产物送华大基因科技公司，对PCR产物纯化后测序，测序引物使用PCR扩增引物。在GenBank中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）应用blastn对获得的基因片段进行同源性检索。

　　2结果

　　2.1真菌ITS2序列扩增及序列分析ITS2序列通用引物扩增的9种真菌，电泳显示在200bp～400bp范围内出现阳性条带，阴性对照鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组均扩增阴性。分别挑选烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌的PCR扩增产物进行测序，测序结果均与表型鉴定的属种符合。

　　2.2临床分离丝状真菌ITS2序列扩增及序列分析ITS2序列通用引物扩增的7株临床分离丝状真菌，均出现阳性条带。阴性对照鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、人类血细胞基因组均扩增阴性。测序结果显示，血液来源的菌株鉴定为2例烟曲霉菌和1例马耳尼菲青霉菌，眼分泌物分离的菌株鉴定为2例镰孢菌，耳道脓液分离的菌株鉴定为2例黑曲霉菌。

　　3讨论