过氧化氢通过激活氧化应激诱导成骨细胞凋亡

　　【摘要】目的：探讨氧化应激状态诱导成骨细胞系MC3T3-E1凋亡中线粒体途径的作用。方法：采用MTT法检测不同浓度过氧化氢处理后MC3T3-E1的增殖情况；AnnexinV-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡；JC-1流式细胞学检测线粒体膜电位；DCFH-DA流式检测ROS活性。结果：MC3T3-E1过氧化氢处理后，细胞增殖明显抑制呈剂量效应关系，ROS活性和凋亡增加，线粒体膜电位降低。结论：过氧化氢可以增加细胞内ROS水平，通过激活线粒体途径诱导细胞凋亡。

　　【中图分类号】R751【文献标识码】A【文章编号】1004—7484（2013）11—0030—01

　　随着社会人口的老龄化，骨质疏松已经成为一个世界性的公共卫生问题[1]。骨形成和骨吸收在其发病机制中起到了重要的作用，而在各种类型的骨质疏松的发病过程中都伴随着氧化应激水平的升高[2，3]，但是氧化应激在骨质疏松发病中的具体机制还上不明确，本实验通过对诱导成骨细胞氧化应激，探寻其在成骨细胞凋亡中的作用。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　小鼠MC3T3-E1成骨细胞株购自美国培养物保存中心（ATCC，CRL-2593，USA），α-MEM培养基购于GIBCO公司，胎牛血清购于Hyclone公司，H2O2购于碧云天公司，AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于北京赛宝克公司，DCFH-DA和JC-1荧光探针购于MolecularProbes公司。

　　1.2细胞培养

　　小鼠MC3T3-E1细胞培养于含10%FBS、的α-MEM培养基当中。实验分为五组：正常组，0.4mM组（过氧化氢终浓度为0.4mM），0.6mM组（过氧化氢终浓度为0.6mM），0.8mM组（过氧化氢终浓度为0.8mM），NAC组（0.6mM的过氧化氢+25mM的NAC）。

　　1.3细胞凋亡检测

　　采用AnnexinV-FITC/PI法检测。10μl的AnnexinV，5μl的PI染液，避光孵育，流式细胞仪进行检测，CellQuest?软件进行分析。

　　1.4细胞内ROS水平检测

　　细胞内的ROS水平采用DCFH-DA荧光探针进行检测。30μM的DCFH-DA于37℃孵育1h。用无血清的α-MEM培养基洗细胞3次后，流式细胞仪进行检测。

　　1.5线粒体膜电位检测

　　细胞线粒体膜电位采用JC-1荧光探针进行检测。JC-1工作液（300nMJC-1），37℃孵育30min后，倒置荧光显微镜进行检测，并分析荧光强度。此外，细胞加药处理后，常规消化，JC-1染色后，流式细胞仪进行检测，并分析JC-1阳性率。

　　1.6统计学分析

　　采用SPSS17.1统计学软件进行统计学分析。数据采用±s表示，多组间比较采用ANOVA分析，两两比较采用SNK检验，P<0.05表明具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1H2O2诱导MC3T3-E1细胞凋亡

　　0.4，0.6，0.8mMH2O2处理MC3T3-E124h后可以引起明显的凋亡（图1A）。早期相对凋亡率及细胞总相对死亡率明显增加（图1B）（*P<0.05，**P<0.01vs正常组），而此作用可以被NAC抑制早期相对凋亡率总相对死亡率明显降低（图1B）（##p<0.01vs0.6mM）。

　　3讨论