缺血预处理对兔肝细胞冻存的影响(2)

　　1.2.1缺血预处理术前禁食12h，20%乌拉坦以5mL/kg耳缘静脉注射麻醉动物，腹部皮肤褪毛，常规消毒铺巾，腹正中切口进入腹腔，暴露并游离肝脏，分离出下腔静脉、门静脉和肝动脉，NPC组不行特殊处理；IPC5组为无损伤血管夹夹闭肝血供5min，再复流5min；IPC10组为无损伤血管夹夹闭肝血供10min，再复流10min；IPC15组为无损伤血管夹夹闭肝血供15min，再复流15min。
　　1.2.2分离肝细胞采用改良Seglen二步胶原酶灌注法分离肝细胞[20]，收集的肝细胞，加入含20%胎牛血清的PRMI-1640液制成悬液，细胞浓度为4×105/mL。
　　1.2.3肝细胞的低温保存将新制备的细胞悬液移入冻存液（为含15%DMSO、20%胎牛血清的PRMI1640培养液）中，终浓度配制成4×106/mL，然后移入2mL的冻存管中，各组分别制备30个样本。将样本放置4℃冰箱中30min→-20℃冰箱中放置1h→-80℃冰箱中放置4h→然后快速放于-196℃液氮中保存。
　　1.2.4复苏各组分别于2、3、4周后取出样本10个，立即置于37℃水浴箱内解冻复苏。1000r/min离心5min，离心3次，弃去上清液，加入RPMI1640培养液，重新混悬，浓度为4×105/mL。
　　1.2.5指标检测将上述冻存前及复苏后的肝细胞悬液分别取样，用锥虫蓝拒染法测定细胞存活率。将各组肝细胞于复温后各时段分别取样进行培养，并于培养24h后分别取细胞上清液，检测谷丙转氨酶（ALT）。
　　1.3统计学方法
　　采用统计软件SPSS13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1各组冻存前肝细胞存活率比较
　　各组分离肝细胞经过锥虫蓝拒染法检测，肝细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
　　2.2各组不同时段冷冻复温后肝细胞存活率比较
　　用锥虫蓝拒染法测定各时段冷冻复温后肝细胞存活率结果为：①2周时各组比较差异有统计学意义（P=0.00<0.05）。两两比较后发现，IPC5组与IPC10组比较差异无统计学意义（P=0.51>0.05），IPC5组≈IPC10组>NPC组>IPC15组。②3周时各组比较差异有统计学意义（P=0.00<0.05）。两两比较后发现，IPC5组与IPC10组比较差异无统计学意义（P=0.08>0.05），IPC5组≈IPC10组>NPC组>IPC15组。③4周时各组比较差异有统计学意义（P=0.00<0.05）。两两比较后发现，IPC5组与IPC10组比较差异无统计学意义（P=0.16>0.05），IPC5组≈IPC10组>NPC组>IPC15组。此外，还可发现同组不同时段复苏的肝细胞存活率差异均无统计学意义（P=0.17、0.20、0.17、0.50）。见表2。
　　2.3各组ALT检测比较
　　各组不同时间冷冻复温后分别取样进行培养，并于培养24h后分别取细胞上清液，检测ALT。结果为：①2周时各组比较差异有统计学意义（P=0.00<0.05）。两两比较后发现，IPC5组与IPC10组比较差异无统计学意义（P=0.21>0.05），IPC5组=IPC10组0.05），IPC5组≈IPC10组0.05），IPC5组≈IPC10组3讨论
　　自1986年Murry等[21]在对心肌组织的研究中发现缺血预处理效应以来，对于各种组织器官的缺血预处理的相关研究就在不断的进行中，到目前为止已取得了许多重要成果，但仍然存在许多尚未解决的难题，其中之一就是对于不同的器官如何选择合适的预处理时间，从而对器官达到最佳的保护作用以及如何将这一保护作用运用到其它相关的研究中。
　　缺血预处理的保护作用在多种器官中都普遍存在，其具体机制尚未完全明确。不同的研究器官采用的缺血预处理的时间不同，比如Murry等[21]在研究狗的心肌IRI中使用的是5min阻断，5min开放的预处理方式，而Clavien等[22]开展的临床研究中采用的方式是10min阻断，10min开放的预处理方式等等。脑的预处理方式一般为1～2min，心肌试验多采用3～5min，骨骼肌一般为5min[9]。不同的试验者研究的结果可能不同，比如对于肝组织，Yadav等[7]曾对照研究了15min预处理方式，结果显示与5min的处理方式无明显区别。而其他研究则显示[9，23]，5min预处理与15min预处理是有差异的。