香菇液体培养过程中3种胞外酶酶活的变化(2)

　　1.2.6羧甲基纤维素酶（CMC酶）酶活的测定取5g/LCMC-Na溶液（用pH4.6，0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液配制）[5，8，9]1mL、粗酶液1mL，于50℃水浴中准确保温30min，之后的操作方法与1.2.5同。
　　1.2.7漆酶酶活的测定采用ABTS法，具体参考文献[10，11]。3mL酶活反应体系含1nmol/LABTS0.5mL、酶液0.5mL和HOAc-NaOAc（pH4.5）缓冲液2.0mL。在反应的前3min内在420nm处测定吸光度的变化（每15s记录一次）。以1nmol/LABTS0.5mL、HOAc-NaOAc（pH4.5）缓冲液2.5mL的混合液作为对照。
　　1.2.8蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色测定法[12]。具体操作如下：取去离子水0.9mL、粗酶液0.1mL、考马斯亮蓝染色液5mL至试管中，混合均匀，于595nm处测吸光度，以去离子水1mL、考马斯亮蓝5mL的混合液作为对照，设置3个平行试验，取平均值。作牛血清白蛋白标准曲线，得出蛋白质含量。
　　2结果与分析
　　2.1香菇液体培养过程中淀粉酶、CMC酶、漆酶酶活的变化
　　由图1A可知，淀粉酶酶活在培养的第4天达到最高值28.33U。随后，淀粉酶酶活逐渐降低，直到降至第10天的3.94U，在第13天，又出现一个小高峰。这表明香菇液体培养时最先利用的是淀粉。分析原因可能是在生长初期，菌丝生长需要大量的营养物质，而培养基中含有的大量淀粉成为最直接的营养源，这时淀粉酶发挥主要作用，酶活高；接下来酶活逐渐降低可能是因为菌丝体生长消耗了大量的营养物质淀粉，从而阻碍了淀粉酶的酶活。
　　CMC酶酶活对食用菌增产潜力有重要影响作用[13]。由图1B可知，CMC酶在培养前期酶活较低，在第7天达到第一个小高峰，为17.56U，随后酶活稍有下降，但从第10天开始又迅速增加，并在第13天出现最高值，高达41.21U，说明香菇菌丝体利用纤维素较淀粉晚。
　　由图1C可知，漆酶在培养前期酶活处于低水平，且增长极其缓慢，直到第10天才开始迅速增长，并且在第13天达到最大值15.69U，随后几天迅速降低。漆酶的产量与木质素降解率呈正相关关系[14]，它能加速木质素芳香族高分子化合物的分解，为菌丝提供丰富营养；菌丝生长速度越快，分泌的漆酶也就越多，酶的代谢产物醌的含量也就增加了，这可以增强菌种的抗病能力，抑制杂菌的污染[15]。
　　2.2香菇液体培养过程中胞外蛋白质含量的变化
　　粗酶液中的蛋白质主要是各种胞外降解酶，包括试验中测定的淀粉酶、CMC酶、漆酶以及其他未测定的酶类，比如半纤维素酶等，此时蛋白质含量的变化在一定程度上可以反应总酶酶活的变化。由图2可知，在液体培养期间胞外蛋白质含量变化较大，从第4天开始蛋白质含量迅速增加，在第7天时出现峰值0.0585mg/mL，然后含量有所下降，在第13天再次出现一个峰值0.0490mg/mL，与第一个峰值相比较小，然后又迅速下降至0.0195mg/mL，并在试验结束前期有小幅度增加。综合以上3种酶酶活的变化可知，胞外蛋白质含量的变化与总酶酶活的变化基本一致。
　　3讨论