大规模液相合成肽类药物研究进展

　　【摘要】 本文从合成策略的选择、保护基的选择、缩合剂的选择及逐级放大策略的选择几个方面介绍了当今工业化液相合成肽类药物的概况，对存在的问题及最优解决方案给出了一些建议。

　　【关键词】 规模化； 液相合成； 肽类药物

　　中图分类号 R91 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2014）16-0158-02

　　1 液相法概述

　　在液相合成多肽法面世的近50年时间里[1]，许多方面已取得很大进展，尤其是在保护基和缩合方法方面，这大大增加了研究者设计液相合成计划时的选择余地[2]。开始计划大规模合成时，首先要考虑合成方法所采用策略，如一般化学合成尤其是线性合成或相转换合成，片段的选择和这些片段的组装，正交策略的应用等。一旦方法成熟，还须考虑方法的特殊性，如在工业化生产过程中包括化学技术的问题等，还要满足监管部门的相关规定，所有这些在制药过程中必须考虑到。在实验室或在逐级放大过程中这些方面可能会被忽略，但是在工业化生产过程中，以上所述任何一点问题都可能成为逐级放大过程中的难题。

　　2 合成策略的选择：线性合成和汇集合成

　　目标肽的长短决定所采用的合成策略：长度在5个氨基酸以内的肽一般采用线性合成策略（也就是依次按顺序连接氨基酸直到整个序列被组装完毕）；大于5个氨基酸的序列一般采用汇集策略（也就是先合成一系列小的片段然后将小片段组装成最终的目标产物）[3]，如有奥曲肽的液相合成就采用了此策略[4]。这是由于“the arithmetic demon”[5]，就是一个多步反应的总产率主要依赖于每一步的产率。

　　此外，长肽溶剂选择的局限性，也限制了反应方法的选择。若应用混合策略，片段的选择非常重要，必须考虑到以下因素：（1）片段最好包括C-末端Gly或Pro，这样可以最大程度降低消旋的风险[6]；（2）如果无法选择包括C-末端Gly或Pro，那C-末端应该是没有产生消旋倾向的氨基酸如：Ala或Arg[6]；所选小片段一般不长于五个氨基酸。

　　在开始大规模合成之前用几种策略进行小范围试验是较明智的选择。随着能在温和条件下可被裂解且侧链保护基团不受影响的树脂种类的增多，用固相合成法获得0.5～1.0 g范围内的小肽片段是很方便的方法，然后将小片段在溶液里进行连接。这样能及时获得消旋度和片段溶解性的信息。由于固相法是权宜之计，所以推荐合成包括C-末端的D-氨基酸的对应异构体，利用这个目标肽的非对应异构体用HPLC来检测在连接小片段过程中的消旋度是非常方便的[7]。

　　3 保护基

　　3.1 α-氨基的保护

　　对于大规模液相合成，最常用的氨基保护基是叔丁氧羰基（Boc）和苄氧羰基（Z），这两个保护基在脱保护步骤中形成易挥发性物质[2]。但很少用Fmoc基，因为副产物二苯并富烯反应活性和溶解性都较差。用酸脱除Boc基，对于大规模合成的产品最常用的试剂是无水三氟乙酸（TFA）和HCl/乙酸乙酯的混合物。盐酸盐一般是固体而不是油状物质，这样就容易被分离。Z基一般用还原法去除，通常用H2/催化剂进行催化氢解，但也常用Na/液氨进行还原。过去也常用HBr/醋酸进行还原，不过在大规模生产中，用无水乙醚沉淀分离的氢溴酸盐容易吸湿是此法的欠缺所在。

　　3.2 羧基的保护

　　一般大规模液相法合成中羧基采用裸露策略，当然这样就限制了缩合试剂的选择。然而许多肽以C-末端氨基化合物的形式存在，这就没必要进行羧基的保护。如果需要保护，那苄基或叔丁酯基（tBu）是首选。它们分别与Z基和Boc基有相同的去除方式，所以它们必须与α-氨基保护基正交。如果用脂族酯（如，甲酯或乙酯），用NaOH或KOH进行皂化反应是去保护的方法，虽然这有带来消旋的风险，或存在像Pro这样的受阻氨基酸，反应效率非常低。不过这些简单酯可以用肼处理后转化为肼盐，而随后肼盐在叠氮法中可被直接用来进行缩合反应。

　　3.3 支链的保护

　　对于大规模合成法侧链采用最小保护策略，这可以减少总的反应步骤数。我国丁文峰等[8]做了用最小保护策略合成胸腺五肽的工艺研究。工业生产中侧链不提倡采用完全保护策略：Orn和Lys的δ-氨基和ε-氨基必须像α-氨基一样分别用Z和Boc基来进行保护[2，6，9]。Asp和Glu的羧基功能团必须被保护，一般适宜用跟上面提到的α-羧基相同的酯进行保护，如苄酯或叔丁酯[2，6，9]，选择侧链保护基的时候应当将正交策略考虑进去。Cys的巯基功能团可以用Acm或苄基的硫化物，前一个保护基用碘去除同时生成二硫化物，后一种保护基用适宜用Na/NH3（液）进行还原去除（注：三苯甲基是另一种可用的保护基，并且Acm和三苯甲基的组合物更有利于形成点对点的环化）[2，9]。侧链最小保护策略不利的一面是肽更需有好的水溶性，而这常常使后续的萃取工作复杂化。在这种情况下，完全保护策略可是替代的方法，前提是所选的保护基团应该能同时被去除。

　　4 缩合技术

　　4.1 线性缩合法

　　目前有许多可供选择的缩合方法，其中最常用的是混合酸酐法[10]，碳二亚胺法（如DCC），水溶性的碳二亚胺（WSCDI）[11]，和脲鎓试剂法（TBTU，HBTU）[12-13]。除了这些方法，可供商业化利用的预先活化的氨基酸衍生物，如活化酯（如HOSu和HONp酯）[14]，及N-羧基内酸酐法（NCAs）[15-16]也可以应用。这些衍生物还有另外一些好处，一是不会因活性试剂而产生副产物，另一点是它们能与没被保护的C-末端残基的氨基组分共存。后一种情况在叠氮化物缩合法中也存在[17]。但对于碳二亚胺法和TBTU法，C-末端是必须要带保护的。其他一些新型的缩合剂如BEP、FEP等，我国的LI等[18]也做了相关的研究。

　　4.2 片段缩合法

　　在缩合肽片段时，消旋的风险就增加，主要是由于可能生成了噁唑酮。不过还是有几种方法可供此类型缩合利用，最常用的是添加了辅助亲核试剂（如HOBt，HOAt，HOSu）[19-20]的碳二亚胺法（如DCC或WSCDI）。另一种试剂是TBTU，由于它的商业实用性的增加而在最近几年变得受欢迎[11]。用氯甲酸异丁酯，带或者不带辅助性亲核试剂的混合酸酐法是另一种常用的方法，由于它是曡氮化物法，本身伴随产生消旋的几率低。不过，在叠氮化物法中产生的副产物N3-阴离子还是带来安全隐患。

　　5 逐级放大策略中的技术因素

　　在任何一个多步骤反应进程中，为了增加产率，需将步骤控制在最少[4]。很明显，如果产率相同，一个十五步的合成反应将比十步的合成反应更加费力，且花费也更多。如果可用一个可替代的合成路线，那么一个有较高产率的较长的反应序列也许会是有益的。另外，推测一个较长的反应更费时费力，所以需要认真评估整个过程中的总的经济状况。