冷冻法处理带毒灰飞虱研究初报

　　摘要：为了加快灰飞虱传病毒病接种鉴定的速度，研究了冷冻处理带毒灰飞虱的最佳时间以及对灰飞虱传毒及羽化能力的影响。结果表明，-20 ℃冷冻处理带毒灰飞虱20 min不影响灰飞虱传播水稻条纹病毒，冷冻处理对灰飞虱传毒能力和羽化的影响不明显。
　　关键词：冷冻法；水稻条纹病毒；灰飞虱；传毒；羽化
　　中图分类号： S435.112+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0117-02
　　水稻条纹叶枯病是由是由灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallén）传播水稻条纹病毒（rice stripe virus，RSV） 引起的一种重要的水稻病害[1]，最早于1897年在日本关东地区发生[1]。在我国，该病于1963年在江苏南部地区始发[2]，目前已扩及到全国18个省（市、自治区），其中以江苏、浙江、山东、河南、云南等地粳稻田发病更为普遍，20世纪90年代在全国粳稻种植区流行，造成水稻严重减产[3]。在江苏省，该病1998年在部分稻区流行，2001年在大部分稻区暴发流行且不断蔓延，2002年重病田病株率50%[4]，2004年发病面积占江苏水稻种植面积的79%，部分田块绝收，2005年发病面积持续扩大，并开始向浙江、安徽、河南、山东、上海等周边省（市）蔓延，引起了很大社会反响[5]。在江苏建湖等地，还发现水稻条纹病毒危害小麦的现象[6]。2005年以后，江苏省通过推广防控技术和种植抗病品种，使水稻条纹叶枯病的危害逐渐降低。然而，鉴于病毒病害突发性和爆发性的特点，以及单一性抗性基因存在的隐患，新抗性资源的继续发掘和抗性品种的选育刻不容缓。
　　抗病新资源的发掘和新抗性品种的选育，首先需要稳定、科学的接种鉴定方法，周彤等建立的水稻条纹叶枯病苗期接种鉴定方法[7]稳定可靠，是水稻条纹叶枯病抗性鉴定的首选方法，但是接种鉴定过程中发现，由于传毒介体灰飞虱的移动性较强，定量接种灰飞虱成为一件操作复杂而繁琐的工作。本试验对冷冻法处理带毒灰飞虱进行了研究，为水稻条纹叶枯病等灰飞虱传病毒病的接种鉴定提供了一种处理携带病毒灰飞虱的新方法（国家发明专利[8]），大大加快了灰飞虱传病毒病接种鉴定的速度，为加快抗病品种的鉴出速度和选育进程提供了技术支持。
　　1材料与方法
　　1.1水稻材料和传毒介体
　　水稻材料：感病品种武育粳3号（武进稻麦良种场提供）。
　　传毒介体灰飞虱的筛选与饲养：2005年从江苏省海安县水稻条纹叶枯病重病区稻田采集灰飞虱若虫，在育有武育粳3号幼苗的玻璃杯中饲养，交配后单头雌虫单独产卵，雌虫产卵后采用周益军等的方法[9]检测其携带RSV情况，带毒雌虫后代在育有武育粳3号幼苗烧杯中饲养，饲养2～3代后同上法再筛选1次，所得纯系经2～3代扩繁后用于接种试验。试验过程中定期进行筛选，使供试虫的带毒率维持在80%以上。
　　1.2冷冻时间梯度
　　取6个干燥玻璃杯并编号，每杯放100头3～5龄带毒灰飞虱，纱布封口后，放于-20 ℃冰箱冷冻处理，并开始计时，每10 min取出1杯，取出后迅速将灰飞虱倒于白纸上，观察并记录灰飞虱活跃状态、苏醒时间及死虫数，调查完后将冷冻过的灰飞虱在育有武育粳3号幼苗的1 000 mL烧杯中单独饲养，第2天统计死亡虫数。
　　1.3冷冻灰飞虱对其传毒能力的影响
　　武育粳3号浸种、催芽，至0.5叶时播于250 mL玻璃杯中，每杯播12株，共6杯。从带毒灰飞虱群体取130头，-20 ℃ 冰箱中冷冻20 min，然后取120头接种武育粳3号1.5叶龄幼苗，重复3次；另外取120头不经冷冻处理的带毒灰飞虱接种武育粳3号1.5叶龄幼苗，重复3次。玻璃杯纱布封口，于22 ℃、光周期14 h光照/10 h黑暗条件下饲养，48 h 后移走全部灰飞虱，移栽大田，移栽7 d后开始调查，每隔1 d调查1次，共调查15次，以最后一次调查结果计算发病率。
　　1.4冷冻灰飞虱对其羽化的影响
　　灰飞虱4龄若虫置于-20 ℃冰箱冷冻处理20 min，转移至育有武育粳3号幼苗的250 ml玻璃杯中饲养，每杯30虫，共5杯。若虫羽化后，统计羽化成虫数，计算羽化率。饲养若虫的水稻苗继续管理，直至冷冻灰飞虱所产的卵孵化。
　　2结果与分析
　　2.1灰飞虱冷冻时间
　　对灰飞虱-20 ℃冷冻处理10 min，不昏迷、仍可跳动，仍不利于纸上计数，但随着冷冻时间延长，灰飞虱的生命力受到影响。冷冻40 min以上，死亡率达约17%，死亡率和复苏时间都随冷冻时间的延长而增大（表1）。综合复苏时间与死亡率，带毒灰飞虱冷冻处理以-20 ℃、20 min较合适。