木薯原生质体培养的影响因子研究

　　摘要：原生质体技术是细胞工程的核心部分，是进行作物改良和种质创新的重要方法?；外植体来源及预处理?；酶液组成和浓度?；酶解时间?；酶液渗透压?；培养基组成?；培养方法?；培养密度等对原生质体培养均有很大影响?；对影响木薯（Manihot esculenta Crantz.）原生质体培养再生植株的相关因素进行了综合分析，探讨了原生质体培养在植物育种上的应用潜力?；

　　关键词：木薯（Manihot esculenta Crantz.）；原生质体；培养

　　中图分类号：S889+5；Q242文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）11-2679-03

　　Factors affecting Protoplast Culture of Cassava

　　FU Li-li，TAN De-guan，HAN Bing-ying，SUN Xue-piao，ZHANG Jia-ming

　　（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Haikou 571101，China）

　　Abstract： Protoplast technology， the core of cell engineering， is the important method of crop improvement and germplasm innovation. Source and pretreatment of explant， solution composition and concentration of enzyme， enzymatic duration，osmotic pressure of enzyme solution， composition of the medium， culture methods， culture density and other factors had a great influence on protoplast culture. The factors affecting plant regeneration from protoplast of cassava（Manihot esculenta Crantz.） were analysized comprehensively. The potential of apply protoplast culture in plant breeding were discussed.

　　Key words： cassava（Manihot esculenta Crantz.）；protoplast；culture

　　基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（2010CB126602）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ITBB110501）；海南省重大科技项目子课题热带生物种质与基因资源研究（ZDZX2013023-1）

　　植物原生质体是去除了细胞壁的裸露细胞，是遗传改良的重要试验体系之一，可应用于无性杂交?；遗传转化和细胞生理学等领域[1，2]?；1968年，Takebe等[3]第一个采用商品酶分离得到烟草叶肉原生质体，并于1971年成功再生成植株?；目前，植物原生质体的研究取得了较快发展，大蒜[4]?；天竺葵[5]?；棉花[6]?；柑橘[7]等的原生质体培养均已获得成功?；而对木薯（Manihot esculenta Crantz.）而言，其原生质体培养再生植株很难，有关于木薯原生质体分离与培养的报道较少[8-12]，至今未建立系统?；成熟的原生质体培养体系?；已有研究表明，影响木薯原生质体培养的因素较多且复杂[11]?；为充分掌握原生质体培养的规律，提高其植株再生频率，本研究从木薯原生质体分离?；纯化?；培养等方面入手，研究影响木薯原生质体培养的主要因素，以期为建立合理?；操作性强的木薯原生质体培养体系提供理论依据，为开展木薯遗传改良和创造新种质提供技术和材料?；

　　1外植体来源及预处理

　　1.1材料来源

　　生长旺盛?；生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响原生质体的培养及植株再生?；用于原生质体分离的较好的外植体有叶片?；根?；子叶?；胚?；愈伤组织及悬浮培养物等，尤其是叶片，因为以叶片作材料不仅取材方便，可以分离出大量均匀一致的细胞，而且叶肉细胞排列疏松，易于去除细胞壁?；目前有关报道中，用于木薯原生质体分离的材料主要是脆性胚性愈伤组织和叶片[8-12]?；

　　1.2材料预处理

　　酶解前对材料进行预处理将有利于原生质体的分离，提高原生质体的产量和活性?；Wallin等[13]将苹果叶片放入附加5% PVP和0.5 mmol/L蛋氨酸的W5盐-糖溶液中进行处理?；分离，提高了原生质体的产量；Nyman等[14]将草莓试管苗暗培养1周，提高了分离出的原生质体的产量?；同时，预处理时间对原生质体产量和活力影响也较大?；用于分离原生质体的木薯脆性胚性愈伤组织无需预处理可直接酶解?；而对于木薯叶片而言，从原生质体产量?；活力和细胞破碎等方面综合考虑，叶片放入CPW-9M溶液中预处理的最佳时间为0.5～1.0 h[9，11]?；

　　2原生质体分离

　　高质量的原生质体是再生植株的关键?；研究认为，胞质浓?；不透明?；大小均匀?；呈圆球状的裸露细胞是高质量的原生质体?；原生质体分离的方法主要有两种：①机械法?；1892年Klercker首次采用该方法分离植物原生质体，排除了外源酶对原生质体结构和代谢活性的有害影响，但产量较低，因此目前该法使用较少；②酶解法?；采用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞壁解离以获得原生质体的方法，可获得大量活力高的原生质体?；因此，原生质体产量和活力与酶液组成和浓度?；酶液渗透压?；酶解时间等有着密切关系?；

　　2.1酶液组成和浓度

　　用于分离植物原生质体的酶主要有纤维素酶?；半纤维素酶?；果胶酶和离析酶等?；实践证明，酶液中各种酶的浓度和比例对木薯原生质体的解离效果具有较大的影响?；酶液浓度过高或过低均不利于原生质体的解离，所以应选择合适的酶液组成与浓度?；以华南8号木薯为例，木薯叶片原生质体分离适宜的酶液组合为1%纤维素酶+0.5%离析酶+1%半纤维素酶[11]，而文峰等[12]分离木薯TMS60444愈伤组织采用的酶液组合为1%纤维素酶+0.04%离析酶+0.01%果胶酶?；

　　2.2酶解时间

　　酶解处理一般在25 ℃左右?；黑暗条件下进行，通常采用混合酶液一步完成?；酶解时间从几个小时至几十个小时，依照不同植物和不同外植体而定?；酶解时间过长对原生质体有伤害，从而影响其产量和活力，而酶解时间过短的话，不能获得足够多的原生质体而满足不了试验需要?；因此，为了获得大量具有活力的木薯叶肉原生质体，酶解时间一般以14～16 h为宜?；酶解木薯胚性愈伤组织，时间则长达18 h?；

　　2.3酶液渗透压

　　因为没有了细胞壁，原生质体对外界环境的渗透压较为敏感，酶液的渗透压和原生质体渗透压相差大，会导致原生质体膨胀或收缩而死亡?；因此，酶液应保持一定的渗透压?；常用的渗透压调节剂有糖或糖醇（葡萄糖?；蔗糖?；山梨醇?；甘露醇等）?；此外，盐溶液也可能起到调节渗透压的作用?；木薯中采用甘露醇（9%）作为渗透压稳定剂?；