宁夏肉牛皮肤病原真菌的分离与鉴定

       摘要：【目的】从患真菌性皮肤病肉牛的毛发、皮屑、痂皮等病料样本中分离皮肤病原真菌并对其进行种属分类鉴定，为牛真菌性皮肤病的诊断及防治提供参考依据。【方法】无菌采集宁夏地区患皮肤病肉牛的毛发、皮屑、痂皮，将病料样本置于载玻片上，滴加10% KOH 溶液1 滴，静置5 min 后进行镜检观察；将病料样本接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）中进行真菌的分离、纯化培养，对分离的真菌用乳酸酚棉兰染液进行染色观察，根据真菌形态学特征对其进行初步分类；用分离的真菌制备浓度为1×108 cfu·mL-1 的孢子悬液涂抹健康ICR 小鼠皮肤，根据其致病性筛选病原真菌；提取病原真菌DNA，对其内部转录间隔区（ITS）进行PCR 扩增并测序，登录NCBIGenBank 数据库，对病原真菌ITS 序列进行同源性比较并构建系统发育树，根据其同源性比较及系统发育分析结果，结合真菌形态学特征对病原真菌作出种属分类鉴定。【结果】病料中含真菌菌丝及链状厚垣孢子，毛发中存在大量小分生孢子；从病料样本中共分离、纯化到23 株真菌，分属于毛癣菌属（Trichophyton ）、曲霉属（Aspergillus）、横梗霉属（Lichtheimia）、链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属（Fusarium）、附球菌属（Epicoccum）、毛霉菌属（Mucor）；小鼠皮肤感染试验表明，分离的毛癣菌属真菌NXGY1、NXGY2 具有较强的致病性，试验组小鼠均出现瘙痒、皮屑增多、形成结痂、脱毛等临床症状；毛癣菌属NXGY1、NXGY2 的ITS 序列长度大小分别为660、662 bp，其同源性比较及系统发育分析结果表明，NXGY1、NXGY2 与疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)同源性高达99% ，在系统发育树上属于同一分支，遗传距离最近。【结论】根据真菌形态特征及系统发育分析结果，鉴定分离的肉牛皮肤病原真菌NXGY1、NXGY2 为疣状毛癣菌(T. verrucosum)。

　　关键词：肉牛；皮肤癣菌；ITS 序列；系统发育分析；疣状毛癣菌
      引言
     【研究意义】动物真菌性皮肤病主要是由皮肤癣菌（dermatophytes）感染引起，动物之间通过接触传播，传染性较强，是一类人畜共患病。目前已发现的皮肤病原真菌有40 余种[1]，主要侵染人及动物的皮肤，毛发、甲等组织，出现皮屑增多、脱毛、渗出、毛囊炎以及痒感等临床症状[2]。本病虽然很少致命，但可导致患病动物生长迟缓、生产性能下降、皮毛受损以及机体抵抗力下降，常给畜牧养殖业造成巨大的经济损失。然而，牛真菌性皮肤病久治不绝，在养殖场存在大规模传染发病，同时，牛皮肤病原真菌也是人患真菌性皮肤病的主要来源[3-6]。因此，对牛真菌性皮肤病的病原分类研究将为牛和人类真菌性皮肤病的诊断及防治提供重要依据。【前人研究进展】Emmous 等[7]根据真菌的分生孢子形态将皮肤癣菌（ dermatophytes ） 分属为毛癣菌属（Trichophyton）、小孢子菌属（Microsporum）和表皮癣菌属（Epidermophyton），并通过了国际植物命名法规（international code of botanical nomenclature）的种属分类规则[8]。在生物分类学上，可将皮肤癣菌分为无性型（anamorph）和有性型（teleomorph）病原真菌，无性型病原真菌包括半知菌门丝囊菌纲丝囊菌目丛梗孢科小孢子菌属、毛癣菌属、表皮癣菌属真菌；有性型病原真菌包括部分亲动物性的小孢子菌属和毛癣菌属真菌[9]，以及可产生子囊果和子囊孢子等有性繁殖结构，归为子囊菌门散囊菌目裸囊菌科的节皮菌属（Arthroderma）和Nannizzia 属真菌。Currah 和Weitzman 等调查发现Arthroderma 属和Nannizzia 属真菌形态特征相似，差异非常小，将其归为节皮菌属（Arthroderma）。目前，中国对牛真菌性皮肤病研究较少，主要集中在临床诊断与治疗上，对病原真菌的种类划分、致病机理、药物筛选及剂型研究较少。【本研究切入点】近年来，随着奶牛和肉牛产业的快速发展，牛真菌性皮肤病呈现出群发性的特点，发病率显著提高，人们对导致牛真菌性皮肤病的病原种类及其生物学特性也缺乏了解，无法对该病进行有效的防控。通过对牛皮肤病原真菌进行分离和种属划分，可为进一步研究牛皮肤病原真菌的致病性和开展牛真菌性皮肤病的诊断及防控奠定基础。【拟解决的关键问题】本研究通过采集宁夏地区患真菌性皮肤病肉牛的病料样本，进行病原真菌分离，并根据真菌形态学特征结合ITS序列同源性比较和遗传进化分析结果对病原真菌进行种属分类鉴定。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 病料样本来源与采集 2013 年宁夏固原市某牛场爆发严重的牛皮肤病，病牛临床症状相似，发病部位主要集中在头面部、眼眶周围、颈部，严重的发生全身性感染，患病处呈圆形、椭圆形脱毛，并覆盖白色鳞屑，病牛经常舔舐、摩擦发病部位，体格明显小于同龄牛，毛发无光泽，且多为犊牛（图1）。2013 年11 月，从宁夏固原市某牛场采集病料样本，病料采集时先用75% 酒精对病牛发病部位消毒，再用灭菌刀片刮取病变与健康皮肤交界处皮屑、毛发、痂皮，本次共采集病料样本15 份，将病料置于无菌密封袋中保存，分类编号，24 h 内镜检并分离、纯化培养。试验时间：2013 年12 月至2014 年4 月，试验地点：宁夏大学临床兽医学自治区重点学科实验室。

　　1.1.2 试剂和仪器 放线菌酮购自Sigma 公司；氯霉素，VB1、肌醇、酵母浸膏、酚红，吐温-80，琼脂糖，TAE 及其它试剂为国产色谱纯或分析纯；乳酸酚棉兰染液；DNA 提取试剂盒、DNA 聚合酶、凝胶回收试剂盒等购自宝生物工程（ 大连） 有限公司（Takara）；引物（ITS1、ITS4）由Invitrogen（上海）贸易有限公司合成；Motic1300 数码显微镜，麦迪奥公司；XSZ-G 型光学显微镜；PCR 仪、凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司。

　　1.1.3 培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，含50 mg·L-1 氯霉素），改良的沙氏葡萄糖琼脂培养基（STIY[10]，含40 mg·L-1 VB1、10 g·L-1 酵母浸膏、0.1g·L-1 肌醇、酚红、50 mg·L-1 氯霉素、0.5 g·L-1 放线菌酮），皮肤癣菌鉴定培养基（DTM）。

　　1.2 病料镜检

　　取少量病料于载玻片上，滴加1 滴10% KOH 溶

　　液，静置5 min 后置于光学显微镜下观察。

　　1.3 真菌的分离培养与形态观察

　　每份病料样本取少量皮屑采用3 点接种法接种

　　于SDA、STIY 平皿培养基中，将接种的平皿分别等份放于30℃和37℃恒温培养箱中培养1—2 w，每天观察菌落生长情况，待长出新生菌丝时，对应接种于SDA、STIY 培养基中，对应置于30℃和37℃恒温培养箱中培养。分离培养期间对菌落进行观察、记录。根据菌株的生长速度、菌落形态、培养基的颜色变化，菌丝及分生孢子形态，对真菌进行初步种属分类。

　　1.4 皮肤病原真菌的筛选

　　将分离的真菌制成孢子悬液侵染健康ICR 小鼠皮肤，根据其皮肤病变情况筛选病原真菌。用生理盐水（含1.0% 吐温-80）冲洗培养7—14 d 的菌落，收集菌丝及孢子，经两层纱布过滤除去菌丝，通过血球计数制得浓度为1×108 cfu·mL-1 的孢子悬液备用；剪去小鼠尾背部被毛（1.5 cm×1.5 cm），用灭菌的细砂纸摩擦小鼠背部，至有轻微液体渗出；对分离的真菌作单一病原侵染试验，试验组取孢子悬液200μL 涂抹于小鼠背部，对照组取200μL 上述生理盐水涂抹，试验、对照组各用6 只小鼠。每天观察记录小鼠的发病情况，包括饮食、饮水、行为、皮肤病变等。皮肤感染10—15 d 后采集发病小鼠的皮屑、痂皮按照上述1.2、1.3镜检、分离培养。

　　1.5 皮肤病原真菌的鉴定

　　1.5.1 病原真菌的形态观察 分别挑取致病真菌的菌丝，经乳酸酚棉兰染液染色进行显微观察，根据真菌分生孢子及分生孢子梗的形态作初步分类，并通过数码显微镜拍照记录。

　　1.5.2 病原真菌ITS 序列扩增与测序 采用玻璃匀浆器（10 mL）研磨法提取病原真菌基因组DNA，用镊子刮取约100 mg 病原真菌菌丝于灭菌玻璃匀浆器内，加入350 μL 细胞裂解液冰浴缓慢研磨成匀浆，置匀浆于2 mL 灭菌离心管中，采用Takara 公司DNA提取试剂盒提取病原真菌基因组DNA。采用引物ITS1（5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）[11]扩增病原真菌ITS 区域，该区域包括ITS1、5.8S rRNA、ITS2 全序列，及部分18S rRNA、28S rRNA 序列。PCR 反应体系为25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2.0μL，rTaq 0.125 μL，引物各1 μL，模板DNA 0.5 μL，加双蒸水至25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒纯化回收PCR 产物，将PCR 纯化产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

　　1.5.3 病原真菌同源性比较与遗传进化分析 登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov，将测定的ITS 序列用BLAST 程序与GenBank 中的ITS 序列进行核酸序列同源性比对，选择相关属真菌的ITS 序列构建系统发育树。运用MEGA 4.0 中的Clustal W 程序对所选择的序列进行排列，采用邻接法（Neighbor-joining, NJ）对排列结果构建系统发育树，进行遗传进化分析。将真菌的ITS 序列提交到NCBI 数据库中，获得GenBank登录号。

　　1.5.4 病原真菌的种属分类 根据遗传进化分析结果、真菌形态结构，并结合文献报道，对真菌进行种属划分。

　　2 结果

　　2.1 病料的镜检

　　镜检发现15 份皮屑病料样本中有6 份含有大量折光性较强的卵圆形分生孢子及丝状真菌，镜检阳性率为40% ；未见疥螨等寄生虫及虫卵，初步判断该皮肤病由真菌感染引起，排除寄生虫感染。

　　2.2 真菌分离

　　从皮屑病料中共分离到23 株真菌（表1），根据真菌分生孢子及分生孢子梗的形态初步分属为：链格孢属（Alternaria）2 株、镰刀菌属（Fusarium）4 株、曲霉属（Aspergillus）7 株、横梗霉属（Lichtheimia）2 结果

　　2.1 病料的镜检

　　镜检发现15 份皮屑病料样本中有6 份含有大量折光性较强的卵圆形分生孢子及丝状真菌，镜检阳性率为40% ；未见疥螨等寄生虫及虫卵，初步判断该皮肤病由真菌感染引起，排除寄生虫感染。

　　2.2 真菌分离

　　从皮屑病料中共分离到23 株真菌（表1），根据真菌分生孢子及分生孢子梗的形态初步分属为：链格孢属（Alternaria）2 株、镰刀菌属（Fusarium）4 株、曲霉属（Aspergillus）7 株、横梗霉属（Lichtheimia）2 株、毛癣菌属（Trichophyton）2 株、附球菌属（Epicoccum）4 株、毛霉菌属（Mucor）2 株。其中，15 份病料样本中有10 份可以分离到毛癣菌属真菌，培养分离率达67% ，且该属真菌在STIY 培养基、37℃ 条件下生长较快；其次横梗霉属、曲霉属真菌分离率分别达40%、47%。

　　2.3 皮肤病原真菌的筛选及病原回收

　　小鼠皮肤感染试验表明，毛癣菌属真菌对小鼠皮肤侵染最为严重（图2）。侵染24 h 后，6 只小鼠头面部、颈部、后肢出现不同程度的瘙痒症状，严重的出现撕咬、皮肤破损；感染10 d 后，6 只小鼠感染部位均出现白色皮屑增多，形成结痂并逐渐增厚，脱毛以致毛发不生长等与发病牛相似的临床症状，整个病程可达35 d 。发病小鼠皮屑、毛发经10% KOH 溶液镜检发现有大量菌丝及椭圆形小分生孢子存在，被感染小鼠的毛发横纹结构消失，发根毛发内产生大量孢子。小鼠皮屑经培养可分离到与侵染真菌显微形态结构相似的菌落，培养阳性率达100% 。横梗霉属、曲霉属真菌对6 只小鼠皮肤亦能产生不同程度的感染，但症状较轻，小鼠发病部位形成坚硬结痂，但15 d 后皮屑逐渐脱落、毛发生长迟缓，小鼠皮屑镜检可见丝状真菌，毛发外具大量孢子，经分离培养可分离、回收到侵染真菌。其它属真菌感染及对照组小鼠未见明显炎症反应，且10 d 后小鼠毛发即生长完全。小鼠皮肤感染试验结果表明，病原真菌主要为毛癣菌属真菌，横梗霉属、曲霉属真菌引起继发感染。2.4 病原真菌的形态特征经培养（图3），毛癣菌属真菌NXGY1、NXGY2

　　形态结构相似，菌落生长缓慢，在STIY 培养基、37 ℃条件下生长较快。培养1 w 可形成白色绒毛菌落，质地坚硬，显微观察菌丝呈丝状，2—6 μm 的梨形、棒形小分生孢子沿菌丝侧生长形成鹿角状菌丝；培养2w 菌落形成白色粉末状菌落，无色素产生，具典型的链状厚垣孢子，显微观察可见横径为3—4 μm 的有隔弯曲菌丝，鼠尾形大分生孢子少见，一般长30—100μm；DTM 培养基培养8 d 可使培养基变红，根据文献报道[12-14]将NXGY1、NXGY2 初步鉴定为疣状毛癣菌（T. verrucosum）。

　　2.5 病原真菌同源性比较及遗传进化分析

　　经琼脂糖凝胶电泳分析，病原真菌NXGY1、

　　NXGY2 的基因组DNA 全序列大小超过5000 bp，ITS序列片段长度约680 bp（图4）。经测序，病原真菌NXGY1、NXGY2 的ITS 序列大小分别为660、662 bp，获得的NCBI GenBank 登录号分别为：KJ816333、KJ816334；ITS 序列同源性比较结果显示，NXGY1、NXGY2 与疣状毛癣菌（T. verrucosum 登录号：

　　AB443930、Z98003、AB491473、AB058851）同源性高达99%—100%；构建的系统发育树表明（图5），NXGY1、NXGY2 与毛癣菌属疣状毛癣菌在同一分支上，自检支持率达86%，表明NXGY1、NXGY2 与疣状毛癣菌遗传距离最近。

　　2.6 病原真菌的种属分类

　　病原真菌NXGY1、NXGY2 具有典型的链状厚垣孢子、鹿角状菌丝，小分生孢子呈梨形或棒形，菌丝分隔、弯曲等显微结构，与毛癣菌属真菌较为相似[15]；其ITS核苷酸序列与疣状毛癣菌的同源性最高、遗传距离最近。

　　因此，根据真菌形态结构、遗传进化分析结果，结合相关文献报道，本研究最终将NXGY1、NXGY2 病原真菌鉴定为疣状毛癣菌。

　　3 讨论

　　牛真菌性皮肤病常造成犊牛大规模感染发病 [16]，通常又称“皮癣”或“钱癣”。 据报道，牛的皮肤病原真菌主要为毛癣菌属疣状毛癣菌，该菌还可引起羊、马、骆驼、驴感染[17] 。此外， 须癣毛癣菌（ T.

　　mentagrophytes）、犬小孢子菌（M. canis）、石膏样小孢子菌（M. gypseum）也可引起牛皮肤感染[18-19]。

　　本研究通过病料镜检及分离、纯化培养，经真菌形态学特征[20-21]对病原真菌作出初步分类鉴定。真菌的ITS 序列具有高度的保守性，常作为真菌近似种及亚种的鉴别依据[22-24]，通过与GenBank 数据库进行真菌ITS 序列同源性比较并进行系统发育分析，鉴定本研究分离的菌株为毛癣菌属疣状毛癣菌。小鼠皮肤感染试验结果表明，所鉴定的毛癣菌具有致病性。本研究还分离到横梗霉属（Lichtheimia）、曲霉属（Aspergillus）等腐生性真菌，鉴定为L. ramosa、烟曲霉（A.

　　fumigatus）及杂色曲霉（A. versicolor），这些腐生性真菌可引起继发感染，具有一定的致病性[25-27]。近年来由于集约化养殖技术的发展，糖皮质类激素及抗生素在畜牧养殖业广泛应用，常导致动物机体免疫力大幅度下降，一些腐生性真菌病发病率逐年上升[28]，值得关注。