大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系的建立

　　摘要：【目的】建立适合于大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）致病性相关突变体的快速筛选体系，为突变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107和5.0×108孢子/mL的孢子悬浮液30min，通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌浓度范围；对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35和45mL的灭菌水，利用血球计数板检测洗脱的孢子浓度，明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响；以保存于96孔板的突变体为单位，在培养皿上进行单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养，培养后于培养瓶中直接加入适宜体积灭菌水洗脱孢子，并将棉花幼苗直接置于含有孢子悬浮液的培养瓶中处理30min，接种后继续培养14d并调查结果；致病性相关突变体的可靠性检验采用定量菌液蘸根接种法，每个突变体接种30株棉花幼苗，3个重复，孢子浓度为5.0×106孢子/mL，每株棉花幼苗按接种5mL菌液计算，处理30min，分别在第5、8、11和14天调查病情指数。【结果】明确了适合于大丽轮枝菌致病力快速鉴定的接种孢子浓度为＞5.0×105孢子/mL；建立了大丽轮枝菌培养方法，单孢纯化培养5d，培养瓶中扩大培养9d，确定了快速定量制备孢子悬浮液的洗脱体积为25mL，测试的20个突变体的洗脱孢子浓度范围在（2.55±0.58）×106—（1.72±0.25）×107孢子/mL；优化了单孢分离、扩大培养、孢子悬浮液制备、接种、继续培养和结果统计等环节，建立了大丽轮枝菌致病性快速鉴定流程，进一步统筹设计构建了大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系；测试表明该体系1人1个循环共7个流程可完成1344个突变体筛选，周期54d，工作量为21人日；采用定量菌液蘸根法重复验证结果，突变体致病力同样显著下降，与快速筛选体系的鉴定结果一致，表明该体系适用于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选。【结论】通过棉花幼苗种植、突变体单孢分离、扩繁培养、孢子悬浮液制备、接种、结果统计等环节的优化和标准化，构建了适合于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选体系，为后续致病相关基因的分离提供了技术支撑。

　　关键词：大丽轮枝菌；致病性相关突变体；致病性鉴定；快速筛选体系
      引言
       【研究意义】棉花黄萎病是由大丽轮枝菌

　　（VerticilliumdahliaeKleb.）引起的世界性土传植物病害和棉花生产的头号病害，平均每年造成15%以上的产量损失，素有棉花“癌症”之称[1]。围绕大丽轮枝菌致病相关基因的筛选与功能鉴定已成为解析其复杂致病机理的主流方向，其中大丽轮枝菌T-DNA随机插入突变体库的构建和筛选是重要手段之一。近年来，国内外已经成功构建了多个大丽轮枝菌的T-DNA随机插入突变体库并筛选到部分致病相关基因[2-4]，但针对突变体库的系统筛选和鉴定工作尚未开展，因此建立快速高效的致病性鉴定方法具有重要意义。【前人研究进展】大丽轮枝菌致病机理极其复杂，涉及蛋白激酶、转录因子、效应子、细胞壁降解酶等复杂的基因调控网络[5]。近年来，应用基因组学、蛋白质组学、T-DNA突变等技术筛选了多个与大丽轮枝菌致病相关的基因，如糖基转移酶基因[6]、强致病力大丽轮枝菌特异基因VdSSP1[7]、坏死和乙烯诱导蛋白VdNLP1和VdNLP2[8-10]、1号生理小种的无毒基因Ave1[11]、分泌蛋白调控因子VdSge1[12]、黏附转录激活因子Vta2[13]、小G蛋白VdRac1[14]等。然而，大丽轮枝菌复杂的致病机理决定了需要数量庞大的致病相关基因参与，仅编码的分泌蛋白就超过800个，其中221个参与植物细胞壁降解[15-16]。因此，从全基因组层面系统鉴定大丽轮枝菌致病相关基因已成为揭示其致病机理的关键。农杆菌介导的T-DNA随机插入突变是从全基因组层面分离新基因的有效方法，已在尖镰孢（Fusariumoxysporum）[17]、稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）[18]和灰葡萄孢（Botrytiscinerea）[19]等植物病原真菌中成功应用。近年来，该技术也成功应用于大丽轮枝菌功能基因的筛选，如莴苣黄萎病菌VdLs.17[2]、棉花大丽轮枝菌Vd991[3]、V592[4]等，并开展了致病性相关突变体的筛选研究。目前，大丽轮枝菌致病性鉴定的方法主要有病圃鉴定法[20]、针刺接菌法[21]、水培法[2,4]、纸钵撕底法[22]、无底塑钵菌液浇根法[23]、蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法[24]、毒素鉴定法[25]等，其中应用于致病性相关突变体的筛选主要是定量蘸菌液法[22,24]和水培法[2,4]。定量蘸菌液法尽管可以用于大丽轮枝菌致病性相关突变体的批量筛选，但存在孢子浓度定量繁琐、接种苗数要求多、根系接菌不均一、鉴定结果周期长等问题；水培法虽然发病速率快，但同样存在孢子浓度定量繁琐、不易操作、易受其他杂菌污染等问题。以上这些因素导致筛选流程费时费力、鉴定周期长，严重制约了大丽轮枝菌致病性相关突变体的筛选研究。因此，建立适用于批量筛选大丽轮枝菌致病性相关突变体的体系已经成为分离致病相关基因的必要条件。【本研究切入点】传统大丽轮枝菌致病性的鉴定方法不适用于大规模大丽轮枝菌T-DNA突变体的快速筛选。本研究以接种大丽轮枝菌孢子悬浮液浓度对棉花黄萎病发病的影响为切入点，通过对孢子悬浮液快速制备、接种孢子浓度、突变体培养、突变体致病性快速鉴定等环节的研究，建立大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系。【拟解决的关键问题】明确引起棉花黄萎病的孢子接种浓度，建立标准化的大丽轮枝菌突变体培养方法，优化定量制备孢子悬浮液的条件，进而建立适用于批量筛选大丽轮枝菌致病性相关突变体的体系，为突变体库致病性相关突变体的系统筛选和致病相关基因的分离提供技术支撑。

　　1材料与方法

　　试验于2013年5月至2014年4月在中国农业科学院农产品加工研究所完成。

　　1.1材料

　　供试野生型菌株为来自棉花的大丽轮枝菌

　　Vd991；突变体来自笔者实验室构建的农杆菌介导的大丽轮枝菌T-DNA随机插入突变体库[3,26]；供试棉花材料为高感棉花黄萎病的品种“军棉1号”（Gossypiumhirsutumcv.Junmian1）。

　　1.2大丽轮枝菌的培养

　　采用标准培养瓶（Φ=60mm，高85mm）培养大丽轮枝菌。于培养瓶中加入约15mL的PDA培养基（200g·L-1去皮马铃薯，20g·L-1蔗糖，18g·L-1琼脂粉），待培养基凝固后加入若干灭菌玻璃珠。于培养皿（Φ=60mm）中对大丽轮枝菌进行单孢分离，挑取单菌落于培养瓶中并摇晃玻璃珠涂布均匀，25℃培养9d。

　　于超低温冰箱中取出保存于96孔板的大丽轮枝菌突变体菌株（15%甘油冻存），吸取20μL于含有PDA培养基及灭菌玻璃珠的培养皿（Φ=60mm）中，逐一对应编号，涂布后于25℃培养5d至长出单个菌落。用灭菌牙签一一对应挑取单个菌落于96个含有PDA培养基和灭菌玻璃珠的培养瓶中，摇晃玻璃珠均匀涂布后于25℃恒温箱中培养9d。

　　1.3棉花幼苗种植

　　培养土（营养土与蛭石按3﹕7比例混合）装入底部带吸水孔的塑料白盘（310mm×220mm×60mm），离上沿约1.5cm，适当平整后置于托盘中并注水，直至培养土表面湿润。取棉花种子均匀播种，随后覆盖培养土并在人工恒温气候室中培养15d，28℃，光暗比14h﹕10h。

　　1.4接种条件优化

　　于培养好的大丽轮枝菌培养瓶中加入适量的灭

　　菌水，摇晃洗脱分生孢子，采用血球计数板分别制备5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107、5.0×108孢子/mL的孢子悬浮液。棉花幼苗轻轻拔出，去除土壤基质后将根系置于孢子悬浮液中处理30min，期间准备若干打孔的纸钵（一次性纸杯，220mL），培养土装至1/4处，随后将接种的棉花幼苗移入纸钵中并覆盖培养土后，放在托盘内继续吸水至培养土表面湿润，然后置人工恒温气候室中继续培养，28℃，光暗比14h﹕10h，每个处理接种30株棉花幼苗，3个重复，清水为对照。接种后注意观察棉花发病情况，以确定引起棉花黄萎病发病的接种孢子浓度范围。

　　1.5大丽轮枝菌孢子悬浮液的定量制备

　　按1.2方法培养大丽轮枝菌Vd991，分别加入15、25、35和45mL的灭菌水，设3个重复，洗脱分生孢子后计算悬浮液的孢子浓度，并根据适合引起棉花黄萎病的孢子浓度范围，确定定量制备孢子悬浮液所需加入的灭菌水体积。随机选取20个农杆菌介导的T-DNA随机插入突变体菌株，按相同条件培养并加入上述确定的灭菌水量，制备孢子悬浮液并计数，检测定量制备孢子悬浮液的浓度范围。

　　制备突变体孢子悬浮液时，根据上述确定的定量制备孢子悬浮液所需加入的灭菌水体积，于培养瓶中逐一加入灭菌水并摇晃洗脱分生孢子，备用。

　　1.6大丽轮枝菌致病性相关突变体筛选体系

　　突变体接种时，直接将棉株置于已洗脱孢子悬浮液的培养瓶中，处理30min后转移至含有1/4体积培养土的纸钵中，随后覆盖培养土并转移至独立的塑料钵（Φ=70mm，高100mm），每个突变体接种5株棉花幼苗，接种后置于人工恒温气候室中组培架（1300mm×600mm）上，每层均按96孔板（12×8）的顺序布局，对照分别为接种野生型Vd991和灭菌水，接种后避光培养2d，随后28℃，光暗比14h﹕10h条件下继续培养。接种14d后观察棉花发病情况，以野生型Vd991接种的棉花幼苗的发病情况为参照，定性判断（或者定量统计发病株率、发病叶片率）并筛选致病力显著下降或者丧失的突变体。

　　根据突变体单孢纯化、培养、接种和致病性相关突变体筛选等环节，进一步优化整个接种流程，根据流程时间节点统筹设计，建立可标准化、流水线作业的大丽轮枝菌突变体高通量筛选循环。

　　1.7致病性相关突变体检验

　　致病性相关突变体的可靠性检验采用定量菌液蘸根接种法，棉花幼苗于5.0×106孢子/mL的孢子悬浮液处理30min，每个突变体接种30株棉花幼苗，每棵苗按接种5mL菌液计算，野生型Vd991为对照，灭菌水为空白对照，3次重复。接种后于第5、8、11和14天调查，病情指数计算参照国家标准《棉花抗病虫性评价技术规范—黄萎病GB/T22101.5-2009》。

　　2结果

　　2.1大丽轮枝菌孢子浓度对棉花黄萎病的影响

　　采用裸根蘸菌方法接种，在浓度为5.0×104孢子/mL条件下，接种14d后即表现出明显的黄萎病症状，病情指数为43.33，表现为强致病力，与Vd991强致病力的表型相吻合；接种浓度为5.0×105孢子/mL时，棉花幼苗开始出现典型的黄化萎蔫和植株枯死症状，病情指数高达68.33；而当浓度大于5.0×106孢子/mL时，接种棉花幼苗均萎蔫枯死，病情指数高于96.6（图1、表1）。结果表明，当接种大丽轮枝菌Vd991浓度＞5.0×105孢子/mL时，即表现出严重的黄化萎蔫和植株枯死的症状，适合应用于大丽轮枝菌的致病性鉴定。

　　2.2大丽轮枝菌培养和孢子悬浮液制备的标准化研究建立了标准化的大丽轮枝菌培养流程，即用培养瓶培养大丽轮枝菌，便于直接进行大丽轮枝菌孢子洗脱和后续棉花幼苗蘸根处理。结果表明，甘油管菌株培养5d后即可长出约1mm的单菌落，单菌落转移到培养瓶中继续培养9d即可布满菌丝，扩繁出足量的菌丝体和孢子。制备孢子悬浮液时，加入15、25、35和45mL的灭菌水洗脱孢子，浓度分别为（9.83±0.48）×106、（5.37±0.13）×106、（3.53±0.36）×106和（2.18±0.18）×106孢子/mL，其中加入25mL灭菌水制备的孢子悬浮浓度为（5.37±0.13）×106孢子/mL，与接种棉花并表现为高致病力的孢子浓度5.0×106孢子/mL接近，孢子浓度适合接种棉花（图2-A）。随机选取20个突变体进行培养，加入25mL灭菌水后制备的孢子悬浮液浓度范围在（2.55±0.58）×106—（1.72±0.25）×107孢子/mL（图2-B），均大于接种后表现为强致病力的孢子浓度（5.0×105孢子/mL）。结果表明，在批量大丽轮枝菌培养和定量制备孢子悬浮液时，加入25mL灭菌水为最适宜的洗脱体积，制备的浓度大于5.0×105孢子/mL，适合于后续大丽轮枝菌接种棉花幼苗。

　　2.3大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系在优化接种浓度和制备孢子悬浮液条件的基础上，构建了大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选方法（图3）。单孢分离和培养：突变体培养5d后均能够完全活化并形成单个菌落，单菌落继续培养9d即长出致密菌丝，100%得到扩繁，该环节需0.5人日。孢子悬浮液制备和接种：加入25mL水悬浮孢子，同时将准备好的棉花幼苗直接置于培养瓶中接种，处理后转移至独立营养钵中继续培养，需要0.5人日。致病性相关突变体筛选：根据野生型和水处理对照的病征表型，接种后14d统计结果，定性判断可以获得致病力显著下降或者完全丧失的突变体，定量标准可以统计棉苗株数（5株）或者叶片（20片）的发病率，该环节需要0.5人日，整个流程从棉花幼苗培养开始到获得统计结果仅需30d，其中实际工作量仅为1.5人日，鉴定周期短，工作量小。

　　按上述流程进一步优化棉花幼苗种植、突变体单孢分离、扩繁培养、棉苗接种和结果统计等各个环节，结合时间节点和工作量，建立可连续循环的高通量大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系（图4）。

　　该体系每个循环包含7个流程，周期54d，每天仅需开展1项独立的环节，每个流程1人可同时筛选2×96个突变体，单个循环可以完成1344个突变体，工作量仅为21人日。应用该体系开展大规模致病性相关突变体筛选，以16000个突变体计算，两名科研人员264d（一年内）即可完成突变体库中致病性相关突变体的筛选。

　　2.4大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系的测试以本实验室构建的大丽轮枝菌T-DNA随机插入

　　突变体库为对象，对建立的筛选体系效率进行了测试。

　　结果表明，54d即完成了7个流程，共计1344个突变的筛选鉴定，实际工作量与理论值21人日一致。在筛选的突变体中，有69个突变体致病力下降，其中16个突变体致病力显著下降或丧失（图5），53个突变体接种后棉花的叶片发病率低于50%，另外1275个突变体致病力无变化或者下降不明显（叶片发病率高于75%）。结果说明，大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系各个环节和流程的时间和工作量设计合理，筛选效率高，适合用于大丽轮枝菌T-DNA随机插入突变库的高通量筛选。

　　2.5筛选体系的可靠性验证

　　随机选取6个应用上述筛选体系获得的致病力丧失或者显著下降的突变体，采用传统的定量菌液蘸根法进行致病力检测。结果表明，与野生型Vd991的强致病力相比，致病性相关突变体对棉花幼苗群体仍表现为致病力丧失或者显著下降，达极显著水平（P<0.01），其中01C06和01E10突变体致病力较对照菌株分别下降了86.01%和77.65%，病情指数与清水对照处理类似（表2），仅极少子叶因生理胁迫（接种时裸根处理）而表现出部分黄化症状。结果表明，本研究建立的大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系结果可靠。

　　3讨论

　　针对大丽轮枝菌致病相关基因的分离，已通过同源克隆、突变体筛选、基因组学、蛋白组学等技术开展了大量研究，初步明确了部分与致病相关的基因，如1号生理小种的毒力基因Ave1[11]、黏附转录激活因子Vta2[13]、蔗糖非发酵蛋白激酶基因VdSNF1[27]、致病型相关分泌蛋白VdSSP1[7]等。然而，大丽轮枝菌致病机理及其复杂，涉及数量庞大的致病相关基因，如何系统分离和鉴定致病相关基因已成为研究热点。近年来，大丽轮枝菌基因组测序已经完成，并构建了莴苣黄萎病菌VdLs.17、棉花大丽轮枝菌Vd991和V592等T-DNA随机插入突变体库[2-4,28]，这为通过突变体库筛选致病性相关突变体并分离靶标基因提供了可能。

　　然而，通过大丽轮枝菌T-DNA突变体库分离和

　　鉴定到的致病相关基因鲜有报道，莴苣黄萎病菌VdLs.17的突变体库仅完成了181个突变体的筛选，获得3个致病相关基因[2]，针对棉花黄萎病菌致病相关突变体的筛选进展亦十分缓慢[28]，其主要的原因是尚未建立高效的大丽轮枝菌致病性快速鉴定方法。

　　当前，大丽轮枝菌致病性鉴定的方法主要有针刺接菌法[21]、纸钵撕底法[22]、无底塑料钵菌液浇根法[23]、毒素鉴定法[25]、水培法[2,4,28-29]等。但这些方法应用于突变体库的筛选存在3个主要问题：一是接种时需要逐一定量测定突变体孢子浓度；二是根系接种不均一、发病周期长；三是接种要求苗数多、占用资源多。如蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法尽管适用于准确鉴定某一菌株的致病力[24]，但应用于突变体库筛选时，定量测定孢子浓度、伤根接种不均一、接种苗数多、调查周期长（28d）等因素限制了突变体库的高通量快速筛选。