杂交瘤细胞培养及其注意事项(2)

　　2.2关于培养液的配置 杂交瘤细胞的培养液采用的是10～20%胎牛血清添加至DME或RPMI-1640中作为基础的培养液。因为血清之间质量差异甚大，影响试验结果稳定性，常需多次筛选，在筛选稳定后，应采用统一批次的血清和培养液进行细胞融合，从而避免血清和培养液的问题导致的试验结果不稳定。笔者曾碰到过因为更换培养液而导致融合细胞后杂交瘤细胞大量死亡的事故。实验过程中此类问题应该尽量避免。 

　　2.3关于培养 动物细胞在体外增殖的方式可以分为两种：一种是在培养液中自由悬浮生长的悬浮细胞；另外一种是贴附在固相基质表面生长的贴壁细胞（ADC，Anchoragedepen-dentcen）。杂交瘤细胞系是由骨髓瘤细胞与免疫动物的脾细胞融合形成的，不是一种严格的ADC细胞。不同的细胞系，细胞之间的贴壁依赖性有较大差异[5]。杂交瘤细胞是半悬浮细胞，更换培养液时只需要每次更换反应器中培养液体积的3/4即可，保持剩余培养液中的细胞作为种子，可以维持反复培养， 减少杂交瘤细胞因受到培养环境变化带来的生理影响，保证细胞活性，同时扩大培养的时候也可将漂浮的部分细胞继续单独培养。 

　　2.4关于传代 扩大培养时避免用1ml的加样枪吹吸细胞，这样可以避免细胞由于强烈的吹打导致细胞的破碎和碎裂。尽量采取无损伤1.5ml的玻璃吸管吹打和传代，可以减少细胞在传代时导致的机械性损伤。

　　2.5关于饲养层细胞 饲养层细胞（小鼠腹腔渗出细胞）的加入有助于促进杂交瘤的生长并可以增加杂交瘤的产量。饲养细胞可以是成纤维细胞，胸腺或脾脏淋巴细胞，但常用的是从同系健康小鼠腹腔中收集的腹腔渗出细胞，主要是巨噬细胞。 

　　2.6关于冻存温度 细胞冻存的过程要经历液体溶液的固化和水分子通过细胞膜的渗透过程，冻存细胞的溶液一旦形成冰晶，高渗透压的环境会导致细胞内外环境的改变，会增加防冻剂对细胞毒性造成细胞的损伤。这是由于细胞内形成冰晶促使电解质浓度升高引起细胞脱水而使细胞失活。当冻存的降温速率过快或复温速度过慢，都会使细胞内形成冰晶，导致细胞的损伤和死亡。通常温度越低，酶活力也越低，细胞新陈代谢也随着降低，保存时间相对延长。 

　　传统的细胞冻存有程序性的降温液氮冻存法和非程序性的降温液氮冻存法。程序性降温液氮冻存法需要购置专用仪器，优点是温度控制较好，对细胞损伤小，有条件的实验室应考虑首选该法；缺点是操作步骤复杂费时，再加上成本昂贵，普及困难。 

　　本实验室，采用的是在添加10%比例的DMSO保护剂后，将细胞悬挂于液氮罐和液氮之间，距离液氮平面大于15cm，2～3h后放入液氮冻存或隔夜放入液氮冻存，都可以保证良好的细胞冻存效果；杂交瘤细胞和sp2/0细胞冻存液里的血清浓度保持在20%的比例。冻存时选择培养处于对数生长期的细胞，在收集细胞前一天换新鲜培养液，第二天收集细胞冻存[6]。冻存液中血清含量不应低于20%，最高可用90%的血清和10%的二甲亚砜混合的冻存液。血清浓度越高，冻存效果越好[7]。 

　　3结论 

　　尽管杂交瘤细胞大量培养和单克隆抗体制备的研究方面已经取得很大进展，但由于设备条件和技术的限制，国内各实验室大部分仍然是以少量培养和制备为主，还存在着很多优化和改善的空间，以增加后期实验单克隆抗体制备的成功率，从而使单克隆抗体的制备得到更广泛的应用。 

　　参考文献： 

　　[1]方福德.现代医学实验技巧全书[M].下册.北京大学医学出版社，1999：06. 

　　[2]James K and Bell GT[J]. J Immunol Methods，1987，100：5. 

　　[3]董志伟，王琰.抗体工程[M].第二版.北京大学出版，2002：54. 

　　[4]王祥斌，孔健.体外培养杂交瘤细胞生产人用鼠源单克隆抗体[J].中国生物制品学杂志，2002，15（5）：315. 

　　[5]汪美先，辛颜彬，薛小平，等.杂交瘤细胞体外大量培养研究的进展[J].细胞与分子免疫学杂志，1990（02）：63-67. 

　　[6]冯乐平，刘志国.基因工程试验教程[M].第一版.科学出版社，2013：90. 

　　[7]张贇，温伟红.细胞核分子免疫学实用实验技术[M].第一版.第四军医大学出版社，2013：16.