RNAi体外沉默淋巴管内皮祖细胞VEGFR—3基因表达(2)

　　1.5 统计学分析

　　数据均经SPSS13.0软件进行处理，用（）表示；多组间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 体外转染结果

　　N/P=8时，流式细胞仪检测siRNA/PEI转染组转染效率为30%。

　　2.2 各组VEGFR-3 siRNA抑制VEGFR-3表达的分析

　　2.2.1 半定量RT-PCR结果分析 各组VEGFR-3mRNA表达结果显示，空白与阴性转染组之间无差异，siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组与空白转染组和阴性转染组比较均有显著差异，其中siRNA a组抑制效率最高（图1）。

　　Marker 空白 阴性 a b c

　　GAPDH（590bp）

　　VEGFR-3（261bp）

　　A

　　B

　　A：VEGFR-3siRNA/PEI转染LEPCs48h各组VEGFR-3mRNA的表达。B：统计学结果siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组与空白转染组和阴性转染组比较有统计学意义，#P<0.05，*P<0.01，siRNAa组与siRNAb组、siRNAc组比有统计学意义P<0.05

　　图1 半定量RTPCR结果分析

　　2.2.2 Western blot检测结果分析 转染各组细胞VEGFR-3蛋白表达结果显示，空白与阴性转染组之间无差异siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组与空白转染组和阴性转染组比较均有显著差异，其中siRNA a组抑制效率最高（图2）。此结果在蛋白水平上符合半定量RT-PCR的实验结果。

　　空白 阴性 a b c

　　VEGFR-3165KD

　　β-actin 43KD

　　C

　　D

　　C：VEGFR-3siRNA/PEI转染LEPCs72h各组VEGFR-3蛋白的表达。D：统计学结果siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组与空白转染组和阴性转染组比较有统计学意义，#P<0.05，*P<0.01，siRNAa组与siRNAb组、siRNAc组比有统计学意义，P<0.05

　　图2 Westem blot 检测结果

　　3 讨论

　　在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞可经新生的淋巴管转移[11]，论文网站抑制肿瘤淋巴管新生对肿瘤治疗至关重要。LEPCs参与肿瘤淋巴管新生已成为研究热点[12]。LEPCs可迁移和定居到肿瘤，参与肿瘤淋巴管新生[3，13-14]。关于LEPCs参与淋巴管新生的机制尚未完全明确。本实验在体外将VEGFR-3siRNA转染入LEPCs。裸siRNA分子易降解且靶向性差，目前多采用借助载体给药，阳离子聚合物具有较低的免疫原性和细胞毒性多被应用于研究[15]。PEI是一种被广泛用于DNA和siRNA等的阳离子聚合物载体，通过形成纳米粒包裹siRNA后给药[16]。

　　本研究采用分子量为25KDa的PEI为载体介导VEGFR-3siRNA的转染，成功转染VEGFR-3siRNA进入LEPCs内，用RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白质表达，证实了VEGFR-3siRNA对靶基因VEGFR-3的沉默效果。说明通过利用RNAi技术能够在体外靶向抑制LEPCs VEGFR-3的表达，进而干扰VEGF-C/VEGFR-3信号途径，抑制其分化和淋巴管新生。如果以体外实验结果作为基础，将VEGFR-3siRNA导入LEPCs并靶向于肿瘤，可能会抑制淋巴管新生引起的肿瘤转移。