重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌细胞破碎条件优化(2)

　　２结果与分析

　　２．１标准曲线的绘制

　　标准曲线见图１。以蛋白质浓度（μｇ／ｍＬ）为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程：ｙ＝０．００１３ｘ＋０．０４５９，Ｒ２＝０．９９７。

　　２．２酶法与反复冻融法相结合的破碎条件研究结果

　　２．２．１冻融次数对菌体破碎率的影响结果见图２。由图２可见，随着冻融次数的增多，菌体破碎率增加，当反复冻融５次时，破碎率已达９０％，６次时即达１００％。

　　２．２．２冻融次数对ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度的影响结果见图３和图４。由图３和图４可见，反复冻融６次时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度已达到最大。因此反复冻融的次数确定为６次。此时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达１．８６ｇ／Ｌ。

　　２．３酶法和超声波法相结合的破碎条件研究结果

　　２．３．１超声时间对菌体破碎率的影响结果见图５。由图５可见，随着超声时间的延长，菌体破碎率增加，当超声时间达到３０ｍｉｎ时，菌体破碎率达到１００％。

　　２．３．２超声时间对ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度的影响结果见图６和图７。由图６和图７可见，超声时间达３０ｍｉｎ时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达到最大（１．８３ｇ／Ｌ），超声时间进一步延长，ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度不再增加。因此确定超声破碎时间以３０ｍｉｎ为宜。

　　２．４两种方法的破碎效果比较

　　反复冻融６次或超声波破碎３０ｍｉｎ，细胞破碎率均可达到１００％，此时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达到最大，分别为１．８６和１．８３ｇ／Ｌ。反复冻融法操作较繁琐，耗时长，需要添加价格昂贵的ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ降解ＤＮＡ及ＲＮＡ以降低破碎液黏度，且每次处理量不能太大；而超声波破碎时间短、效率高，且对细胞破碎所释放的ＤＮＡ、ＲＮＡ具有一定剪切作用，破碎同时能有效降低其黏度，综合考虑选择超声波破碎为工程菌细胞破碎条件。

　　３结论

　　试验结果表明，重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）破碎的最优工艺条件为：每克湿菌体重悬于３ｍＬ含有２ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ的１×ＰＢＳ缓冲液中，加溶菌酶至终浓度为２００００Ｕ／ｍＬ，室温放置３０ｍｉｎ后超声波破碎３０ｍｉｎ，４℃１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ取上清液。超声波破碎条件：Ｓｏｎｉｃｓ（ＶＣ×６００型）超声波破碎仪，Ф１３ｍｍ螺纹探头和Ф１３ｍｍ螺纹探头可换尖端，振幅７５％，开５ｓ，停５ｓ。此条件下上清液中可溶性ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达到１．８３ｇ／Ｌ。

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