转NAT3基因水稻氮素利用效率分析(2)

　　盆栽基土为含氮量低的黄棕壤，碱解氮含量74.57 mg/kg。晒干后称取8 kg/（盆·干土），分别按不同氮素处理加入相应的营养元素。盆栽试验氮肥处理浓度设计如表1所示，在施用相同磷、钾肥的基础上，设4个氮素处理，分别为全氮（1N）、1/3氮（1/3N）、1/6氮（1/6N）、不施N肥（0N，空白对照），分基肥、分蘖肥和抽穗肥三期施用。NAT3基因超表达株系及对照中花11种子在育秧盘中播种，至四叶一心时选取生长一致的幼苗移栽，每盆种植4株，每个氮素处理种植6盆。抽穗期取3盆植株进行叶片叶绿素含量。成熟后另外3盆收获整个植株（包括根系），烘干后测定生物学产量和含氮量。

　　1.5  叶绿素含量测定

　　抽穗期取倒二叶片，每个处理取3个叶片，每个叶片测定2次。参考文献[12]测定叶绿素含量。

　　1.6  水稻植株含氮量及生物学产量测定

　　收获转基因株系及对照水稻整个植株（包括根系），洗净烘干后称重待测。用凯氏定氮法测定植株含氮量。

　　2  结果与分析

　　2.1  转基因株系中NAT3基因及硝酸还原酶基因OsNR1的表达

　　不同转基因株系中NAT3和OsNR1基因的转录表达情况如图1所示。10个转基因株系中有8个株系的NAT3基因有不同程度的转录表达，其中T4-1、T4-2及T4-3的NAT3基因转录量较高，而株系T4-9、T4-10及非转基因对照中花11中无NAT3基因转录。OsNR1基因在株系T4-1、T4-2及T4-3中有较高的表达量，高于在其他转基因株系与中花11中的表达量。OsNR1基因在不同转基因株系中的表达趋势与NAT3基因的表达趋势基本一致。同中花11相比，株系T4-1、T4-2及T4-3中OsNR1的转录显著增强。结果说明，NAT3基因整合到水稻基因组中后，能够正常表达，而且其超表达促进了下游硝酸还原酶OsNR1基因的表达。选择NAT3和OsNR1基因表达量高的转基因株系T4-1、T4-2及T4-3进行后续试验研究。

　　2.2  不同氮浓度培养基上NAT3基因超表达株系幼苗的生长状况

　　在不同氮浓度培养基上生长的转基因株系T4-1、T4-2、T4-3及对照中花11幼苗的干重结果如表2所示。由表2可知，在1/2MS、1/4MS、1/8MS 3种氮浓度培养基上，3个转基因株系40 d龄幼苗的干重均高于非转基因对照中花11的幼苗干重，其中在1/4MS和1/8MS培养基上转基因株系的幼苗干重与对照之间的差异达极显著水平（P<0.01）。结果表明，同对照相比，转基因水稻幼苗在低氮环境下的生长速度快于非转基因对照。

　　2.3  NAT3基因超表达水稻叶绿素含量分析

　　不同氮素营养条件下，转基因株系及非转基因对照中花11抽穗期倒二叶叶绿素含量如表3所示。由表3可知，随着氮素使用量的降低，NAT3基因超表达株系及中花11的叶片叶绿素a和叶绿素b含量均有不同程度的下降;在1/3N、1/6N及0N处理条件下，转基因株系叶绿素a含量较对照中花11高，但无显著差异（P<0.05）;T4-3在1/3N、1/6N和0N的低氮条件下的叶绿素b含量均显著（P<0.05）高于对照中花11。结果表明，在低氮环境下NAT3基因超表达株系叶绿素含量较对照有所增加，其中株系T4-3中叶绿素b含量显著高于非转基因对照。

　　2.4  NAT3基因超表达水稻植株含氮量及生物学产量

　　不同氮素营养条件下，NAT3基因超表达株系和非转基因对照中花11的含氮量和生物学产量结果如表4所示。由表4可知，转基因株系在1/3N、1/6N的条件下，其植株的生物学产量和含氮量均高于对照，其中T4-1株系在1/3N、1/6N的低氮条件下，其生物学产量和含氮量较对照的差异均达显著水平（P<0.05）;T4-3株系在1/3N、1/6N低氮条件下的生物学产量较对照的差异达极显著水平（P<0.01）。说明NAT3基因的超表达能提高水稻对氮肥的利用效率，提高植株含氮量和生物学产量。

　　3  小结与讨论

　　硝态氮（NO3-）是植物吸收利用的主要氮源之一。硝酸盐转运蛋白是植物硝酸盐转运系统的重要组成部分，分为低亲和性和高亲和性两类。大量研究已经证明，高亲和性硝酸盐转运系统主要负责低NO3-浓度时植物氮的吸收[13-15]。硝酸盐转运蛋白基因NRT2.1缺失突变的拟南芥丧失75%的高亲和性硝酸盐转运系统活性[16，17]，因此导致在以NO3-为惟一氮源的低氮环境下不能正常生长[18]。然而通过在植物中超表达高亲和性硝酸盐转运蛋白基因改变植物的氮素利用效率的研究鲜有。Fraisier等[19]在烟草中超表达高亲和性硝酸盐转运蛋白基因NpNRT2.1，结果表明，不论环境中提供的NO3-浓度水平如何，转基因烟草和野生型对照中的NO3-含量无显著差异。