洋葱Ms位点多重PCR标记的开发与优化(3)
3结论与讨论
本研究通过引物筛选、体系和程序优化获得了一个可同时检测显性Ms和隐性ms等位基因的多重PCR分子标记MK4（UM2、DM2、Um2、Dm2）；PCR扩增体系为10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L的dNTP 6 μL、模板DNA 1 μL（约50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL，用灭菌双蒸水补齐至25 μL；扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。该分子标记系统可以通过一次PCR试验鉴定3种Ms座位基因型（MsMs、Msms、msms）的洋葱材料，扩增结果与基因型完全相符。
多重PCR反应体系和程序与普通PCR极为类似，除了考虑各组分间的比例及退火温度外，还应首先考虑多重PCR引物间的兼容性，引物的兼容性不好，就会造成扩增效率极低甚至无扩增，无法检出相关的等位基因；第二，应该特别注意dNTP的冻融次数，随着冻融次数的增加，扩增效率降低，然而高浓度dNTP可以部分抵消因冻融次数造成的扩增效率降低的现象；第三，本研究未对引物浓度进行优化，原因为终浓度为0.4 μmol/L时，两个等位基因在表观上的检测亮度基本相似，未出现扩增严重不平衡的现象。但在其它多重PCR的开发和应用中，可以通过调整待检测位点的引物浓度，调节扩增条带的亮度，进而达到便于鉴定识别的目的。
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