钙过量对茶树新梢品质成分及根系生长的动态影响(2)

　　茶多酚总量的测定参照GB/T 8313—2002，采用酒石酸亚铁比色法。游离氨基酸总量测定参照GB/T 8314—2002，采用茚三酮比色法。儿茶素、咖啡碱含量的测定采用高效液相色谱法，参考GB/T 8313—2008的检测方法，并略作修改。流动相A：乙腈90 mL，乙酸20 mL，10 mg/mL EDTA溶液2 mL，去离子水定容到1 000 mL；流动相B：甲醇。色谱条件：检测波长278 nm，柱温35 ℃，流速1 mL/min，进样量40 μL，运行时间45 min。梯度条件如表1所示。

　　茶叶中茶氨酸含量测定采用高效液相色谱法[6]。色谱仪为Agilent 1100 Series，色谱柱Symmetry-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.05%三氟乙酸水溶液，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为203 nm，柱温30 ℃，检测时间10 min。每次进样结束后，用乙腈冲洗色谱柱10 min，然后用流动相平衡色谱柱约10 min，至基线平稳，再进行下一组样品的测量。

　　茶树幼苗根系形态分析，采用多功能根系扫描分析仪（EPSON Perfection Flatbed Scanner V700/V900）进行测定，分析总根长、总表面积、平均直径、 根尖数等指标。

　　各处理均进行3次重复，试验数据采用MS Excel 2003、SAS V8.0统计软件进行统计分析，利用LSD法检验差异显著性。

　　2 结果与分析

　　2.1 钙过量对茶多酚含量及儿茶素组成的动态影响

　　前2周钙过量处理与对照茶叶茶多酚含量差异显著，之后差异不显著（表2）。钙过量处理前2周，随着钙离子浓度的增加，茶多酚含量均表现出先增加后降低的趋势，T2处理茶多酚含量最高，分别达到27.51%和27.15%；钙过量处理3～5周，这种趋势发生改变，处理间茶多酚含量差异均不显著。儿茶素总量的变化趋势与茶多酚一致，经过前2周钙过量处理，茶苗新梢儿茶素的组成如图2所示，钙过量条件下表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）的变化比较大，其他儿茶素变化较小，因此，钙过量处理条件下儿茶素总量的变化主要是EGCG和ECG引起的。

　　2.2 钙过量对游离氨基酸、茶氨酸含量的动态影响

　　钙过量处理前2周各处理间茶叶游离氨基酸和茶氨酸含量差异不显著，处理3周后二者含量均开始表现出差异（表3）。处理前2周，游离氨基酸和茶氨酸含量一直比较稳定，变化幅度很小；从第三周至第五周，与对照相比，游离氨基酸和茶氨酸含量随着钙离子浓度的增加显著降低；处理第三周，150 mg/L钙离子浓度（T2）处理条件下开始显著下降；而处理第四周和第五周，90 mg/L钙离子浓度（T1）处理条件下即开始显著下降。

　　2.3 钙过量对咖啡碱含量的动态影响

　　与对照相比，茶叶中咖啡碱含量在钙过量处理条件下存在明显差异（表4）。从第一周至第五周，随着钙离子浓度的增加，咖啡碱含量均出现不同程度的下降。其中前3周咖啡碱含量下降幅度较小；而处理第四周后，咖啡碱含量出现大幅度下降，与对照相比，T1处理条件下即开始出现显著下降，T4处理条件下咖啡碱含量下降0.43个百分点。

　　2.4 钙过量对根系形态的动态影响

　　植物地上部分的生长发育与根系关系密切，本试验在测定茶苗新梢品质成分的同时，利用根系分析仪对根系总根长、总表面积、平均直径、根尖数进行了分析。钙过量处理对根系的影响主要表现在根尖数的显著减少，而总根长、总表面积及平均直径的变化不显著（表4）。根尖数的减少幅度随着钙离子浓度的增加而增加，T1处理条件下，经过5周培养，相对于第一周，根尖数减少了67.4，T4处理条件下根尖数减少量为99.80。随着钙过量处理时间的进一步延长，茶树根系的吸收根不断衰亡，直至根系失去吸收功能，同时茶树新梢也逐步干枯。 

　　3 讨论和结论

　　Ca2+被认为参与促进细胞壁增厚、植物防御素合成及改变活性氧[7]。植物在正常的生长情况下，活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。钙过量胁迫可引起茶树光合系统膜结构的破坏，而叶绿体和线粒体是植物体内活性氧产生的主要部位[8]，胁迫处理增加了植物体内活性氧的产生。植物体内存在的负责清除活性氧产生的抗氧化系统由两部分组成，即抗氧化酶类和抗氧化剂类，二者在植物体内都可清除活性氧。茶多酚是一类以儿茶素类为主体的类黄酮化合物，具有C6-C3-C6碳骨架结构，是重要的天然抗氧化性物质，可对活性氧起到一定的清除作用[9]。本试验中，钙过量胁迫处理初期，较低钙浓度（90、150 mg/L）条件下，茶树体内茶多酚含量的增加可在一定程度上降低胁迫造成的危害，而随着钙浓度的增加或胁迫时间的延长，茶多酚消耗量增加，含量逐步降低。

　　氨基酸是茶叶中的主要滋味物质，能缓解茶的苦涩味，增强甜味，还可以转化成各种香气物质，与茶叶品质呈正相关[10，11]。茶氨酸是茶树中含量最高的游离氨基酸，占茶叶干重的1%～2%[12]。茶氨酸是由根系吸收无机态氮，在茶根部由乙胺与L-谷氨酸生物合成，再经由输导组织运往地上部分，最终运往茶树的各个组织[10]。高钙土壤条件下，高浓度Ca2+会抑制嫌钙植物对其他金属离子的吸收、铵盐的硝化，尤其是对有些嗜好氮肥的嫌钙植物[13]。茶树是典型的嫌钙嗜氮植物，高浓度Ca2+势必会抑制铵盐的硝化；此外，钙过量条件下，茶树根系根尖数减少，且高Ca2+浓度下根系表面会附着一层白色黏膜，这些都会导致根系合成茶氨酸的能力下降。本试验中，钙过量处理2周后，游离氨基酸、茶氨酸含量的显著降低证明了该观点。咖啡碱是茶叶中的另一重要滋味物质，其与茶黄素以氢键缔合后形成的复合物具有鲜爽味，是影响茶叶品质的重要组分[14]。茶叶中的嘌呤可能是在叶绿体中从先质直接合成，这些嘌呤又可以在这里转化成咖啡碱[10]。王跃华等[4]研究表明，钙过量胁迫导致叶绿体膜损伤，基质类囊体片层变得松散，类囊体膜也受到不同程度的破坏。这势必会影响咖啡碱的合成。此外，钙过量条件下，茶树根系根尖数减少，影响根系对氮素的吸收，从而影响到茶树新梢中咖啡碱的合成。 本试验中，钙过量处理1周后，咖啡碱含量出现显著降低。

　　茶树根系中乳白色的吸收根是根中生命活动最活跃的部分。根的伸长、对水分和无机盐的吸收、成熟组织的分化以及对重力与光线的反应都发生于这一区域。吸收根在生长发育过程中不断衰亡更新[5]。嫌钙植物的根细胞不能很好地控制过量胞质钙离子浓度，高钙浓度下，位于等离子体膜中的阴离子通道关闭。胞质钙离子增加，而液泡中有机酸的释放受到影响，液泡中有机酸的积累加剧，pH平衡遭到破坏[15]。这使得高钙浓度对嫌钙植物的伤害首先体现在根系上，根系分析中根尖数能够反映吸收根的衰亡更新情况，本试验中，随着钙过量处理时间的增加，茶苗根系的根尖数不断减少，这表明钙过量条件下吸收根的衰亡占主导。由此表明，钙过量胁迫处理初期，较低钙浓度（90、150 mg/L）条件下，茶多酚可对胁迫伤害起到一定的抵御作用，随着胁迫对根系伤害程度的增加，氨基酸、咖啡碱的合成逐步受到影响。