胰岛素干预对白消安致小鼠生精细胞耗损的恢复效果研究(2)

　　2.1胰岛素对睾丸重量恢复的影响：胰岛素干预后4周（如图1所示），胰岛素干预组小鼠睾丸重量与低剂量白消安损伤模型组相比明显增加（P<0.05），但仍低于对照组（P<0.05）。低剂量白消安损伤模型组睾丸重量明显低于对照组（P<0.05）。

　　图1.胰岛素干预后4周对照组、低剂量白消安损伤模型组和胰岛素干预组小鼠的睾丸重量.

　　2.2胰岛素对生精细胞恢复的影响：胰岛素干预后4周（如图2所示），干预组小鼠睾丸中所有生精小管都为复层生精细胞上皮。而未干预的低剂量白消安损伤模型组小鼠睾丸中有部分生精小管中空，小管中仅有支持细胞存在，中空率为55%，与胰岛素干预组（中空率为0）差异显著（P<0.01）。高剂量白消安损伤模型组小鼠睾丸中生精小管中空率最高，为87%，与对照组和低剂量白消安损伤模型组差异显著（P<0.01）。高剂量白消安处理后几乎造成所有精原干细胞耗竭。

　　图2.胰岛素干预后4周对照组、白消安损伤模型组以及胰岛素干预组小鼠睾丸中生精细胞状态.A.对照组，生精细胞数量多，精子发生完整.B.低剂量白消安损伤模型组，大量生精细胞耗竭，部分生精小管中空.C胰岛素处理组，与为干预的低剂量白消安损伤模型组相比，生精细胞明显得到恢复.D高剂量白消安损伤模型组，生精细胞几乎完全耗竭，所有生精小管接近中空.bar=50?m.

　　2.3热处理对小鼠睾丸GDNF、SCFmRNA表达的影响：胰岛素干预后4周（如图3所示），胰岛素干预组、对照组以及低剂量白消安损伤模型组GDNF和SCFmRNA的表达没有差异（P>0.05）。胰岛素干预后4周，胰岛素对生精小管中支持细胞表达的精原干细胞微环境再生因子GDNF和分化因子SCF基因表达水平都没有影响。

　　图3.胰岛素干预后4周对照组、低剂量白消安损伤模型组以及胰岛素干预组小鼠睾丸中GDNF和SCFmRNA表达情况.A.RT-PCR凝胶图.B.RT-PCR凝胶图灰度分析，SCF和GDNF在对照组、低剂量白消安损伤模型组以及胰岛素干预组3个组间表达差异不显著.n=6.

　　3讨论

　　本研究发现，胰岛素干预可以使得低剂量白消安造成精原干细胞损伤小鼠精子发生得到明显恢复，干预治疗后精原干细胞微环境维持稳定。

　　精原干细胞是男性体内唯一可将遗传性息传递给后代的成体干细胞，其通过源源不断的再生分化，产生精子，从而维持了正常的精子发生[4]。然而精原干细胞对放化疗极为敏感，半致死剂量即40mg/kg体重的白消安腹腔注射通常会造成30%左右的小鼠死亡和睾丸中精原干细胞几乎全部耗竭，在小鼠和大鼠精原干细胞移植实验中，也采用该剂量制备精原干细胞移植受体；30mg/kg体重剂量的白消安也可以用于制备精原干细胞移植受体，该剂量不能彻底杀死精原干细胞，仍有一部分精原干细胞残存，但不会造成小鼠死亡。本研究中采用30mg/kg体重以便造成精原干细胞部分耗竭，以便可以观察胰岛素干预对残存的精原干细胞再生有无作用，该模型比较接近临床中化疗造成不育患者的不育病症。

　　近年来，青年癌症患者治愈率逐年上升，但在癌症治疗过程中化疗往往造成患者精原干细胞损耗进而不育。Ogawa认为青年癌症患者在化疗前采集睾丸活检组织，分离纯化精原干细胞，体外培养扩增后进行冷冻保存，在放化疗后进行精原干细胞原位移植，从而恢复患者生育能力[5]。该方法是一种很好的生育力保存方法，但目前尚未见通过该方法恢复男性生育能力的报道，究其原因可能是目前稳定的人类精原干细胞体外分离纯化以及培养的体系尚未建立[5]。首先，目前尚未发现特异性较高的人类精原干细胞表面标记蛋白，从而使得通过流式细胞仪或者免疫磁珠分离纯化得到的精原干细胞纯度较低；其次，人类精原干细胞体外培养体系仍然没有建立，无法获得精原干细胞系。因此，寻求其他放化疗患者生育力保存方法显得尤为重要。本研究发现，连续7天胰岛素干预，可以明显恢复低剂量白消安损伤睾丸中生精细胞数量，表明胰岛素对精原干细胞再生有明显的促进作用。精原干细胞通过再生、迁移以及分化从而恢复了生精小管中精子发生，使得每个生精小管中出现大量生精细胞，形成完整的精子发生波，进而恢复了生育能力。