绿原酸对Aβ引起的小脑颗粒细胞损伤的保护作用(2)

　　1.5微管相关蛋白-2表达水平培养2天后，观察细胞形态并拍照，收集细胞106，提取细胞总蛋白，应用westernblot方法检测微管相关蛋白-2的表达。

　　1.6乳酸脱氢酶漏出量留取培养的上清液，在pH值为10时乳酸基质在氧化型辅酶I存在的情况下，经乳酸脱氢酶催化反应生成丙酮酸，后者与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在波长为440nm下比色测定丙酮酸二硝基苯腙含量，推算出乳酸脱氢酶漏出量（具体操作按照试剂盒说明进行）。

　　1.7统计分析：实验结果以，应用SPSS13.5分析。

　　2结果

　　2.1细胞活性的检测在细胞处理48h后，应用MTT检测与正常培养的神经细胞相比，正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液组细胞的活性明显下降，仅为正常培养神经细胞的28.35%；说明神经细胞在巨噬细胞培养上清（经Aβ活化后）的作用下引起细胞的大量死亡。而在正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液+200μmol/L的绿原酸组，细胞活性为正常培养神经细胞的75.82%，说明在加入绿原酸后，能明显减少神经细胞的死亡起到保护神经细胞的作用。在正常培养的神经细胞+10μmol/LAβ组，神经细胞的活性为正常培养细胞的91.27%，说明在正常培养的神经细胞中，虽然经过了纯化处理，但仍存在一定的胶质细胞，在Aβ活化后，引起一定神经细胞死亡。

　　2.2微管相关蛋白-2表达在细胞处理48h后，收集细胞，应用westernblot检测，从结果可见，在正常培养的细胞中，MAP-2明显的高表达，但在细胞中加入经Aβ处理的巨噬细胞上清后，MAP-2的表达明显下降，仅为正常组的31.23%（P<0.01）。在加入巨噬细胞上清的同时加入绿原酸后，MAP-2的表达升高明显，达到79.77%（P<0.01），但与正常比还有一定的差距（P<0.05），而在正常细胞+Aβ组，MAP-2的表达仅略有下降（表1，图1）。

　　MAP-2在1组中明显的高表达，但在2组中下降明显，在三组，表达又有显著的上升，在4组中，仅较1组略低。条带1：正常培养的神经细胞；条带2：正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液；条带3：正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液+200μmol/L的绿原酸；条带4正常培养的神经细胞+10μmol/LAβ

　　2.3乳酸脱氢酶检测在正常培养的神经细胞中，乳酸脱氢酶的量只有802nkat/L，但在正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液组中，乳酸脱氢酶漏出量显著升高，达到3046nkat/L，说明神经细胞在加入经Aβ诱导后的巨噬细胞的培养上清液后，大量的神经细胞受损，导致大量的乳酸脱氢酶的漏出，而同时加入绿原酸后，在很大程度上可以减少由巨噬细胞上清液引起的神经细胞膜的损伤，对神经细胞起到明显的保护作用（表2）。

　　3讨论

　　阿尔茨海默病是以进行性痴呆为主要临床特征的神经系统退行性疾病，其病理特征是大脑皮质和海马区域出现神经元缺失、神经炎性斑块和神经原纤维缠结。阿尔茨海默病造成神经元丧失的主要机制是细胞凋亡。许多学者研究表明，Aβ对神经细胞没有直接毒性作用，在纯海马神经细胞培养中加入Aβ，并未出现对神经细胞的杀伤作用[4]。作者对此也进行了初步研究，单独培养的神经细胞中加入Aβ，只见少量的神经细胞死亡，而经Aβ孵育的巨噬细胞的上清液能引起大量的神经细胞凋亡。这些结果表明，Aβ通过激活巨噬细胞，使其释放一些细胞因子，进一步导致神经细胞的凋亡。在单独培养的神经细胞中也出现少量的细胞凋亡，因为在培养神经细胞的过程中即使加入阿糖胞苷，以抑制胶质细胞的生长，但神经细胞不能达到完全纯化，胶质细胞仍存在一定的活性。因此实验中采用Aβ预处理巨噬细胞，再将上清液加入神经细胞培养基中用以模拟体内的生理状态。