火炮打击兔应激防护模型脑组织病理及NMDA—R1表达的形态学研究

　　【摘要】目的探讨实弹演习火炮打击后，不同位置掩体保护下兔脑组织病理及NMDA-R1表达的变化。方法闽南山地团进攻演习，30只实验兔随机分为空白对照组，反角隐蔽组和迎面隐蔽组。火炮打击应激损伤后6h，各组存活兔取脑组织，观察其病理损伤形态学及NMDA-R1表达的变化。结果与空白对照组比较，反角隐蔽组和迎面隐蔽组NMDA-R1表达强阳性，脑组织结构层次被破坏，神经细胞变性坏死，间质出血；迎面隐蔽组NMDA-R1免疫反应强度亦高于反角隐蔽组。结论火炮打击后兔脑组织应激损伤反应强烈，反角掩体保护能够减轻脑组织损伤，NMDA-R1参与脑组织损伤病理过程。
　　【关键词】火炮打击；兔；应激防护模型；脑组织；NMDA-R1
　　正常情况下机体的应激反应是有利的，有助于机体快速适应内外环境因素的变化，但过大过长的应激反应会对机体产生有害的影响，产生病理性应激[1]。病理性应激是机体对严重应激因素（如创伤、打击、爆炸等）的一种异常反应，其生理过程主要表现为下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamo-pituitary-adrenal，HPA）轴神经内分泌调节功能紊乱，导致持续过度的糖皮质激素升高[2]。近年来，人们发现N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartatereceptor，NMDAr）的变化与创伤后神经-内分泌-免疫功能紊乱的发生机制有关[3]。本课题通过建立火炮打击兔应激防护模型，进行应激状态下兔脑组织病理变化及NMDA-R1表达的形态学研究，现报告如下。
　　1材料与方法
　　1.1主要仪器、动物及试剂团进攻炮火覆盖火力类型：武装直升机火箭弹、XX自行榴弹炮、XX牵引加农炮、XX自行火箭炮、水陆两栖坦克、XX轮式突击炮、XX迫击炮、XX反坦克导弹。健康成年日本大耳白兔30只，雌雄不拘，清洁级，体质量2.5～3.0kg（厦门大学医学院动物中心提供），随机表法分为3组，空白对照组6只，反角隐蔽组6只，迎面隐蔽组18只（距离攻击目标10m隐蔽组6只，20m隐蔽组6只，30m组隐蔽6只）。
　　1.2实验方法按照文献[4]方法设计实验，实验时间和环境条件为南方秋季中午山地环境，环境温度16℃～28℃，湿度43%～65%。实验兔常规喂养，演习当日凌晨运至目标高地，炮靶前迎面10m、20m、30m处挖掘约1m深掩体，各放置实验兔6只，上覆盖硬质木板、松枝，留通气道。炮靶后反角10m处挖掘同样掩体，放置实验兔6只。空白对照组于炮靶阵地外10km营区喂养。中午演习开始，全过程2h。轰炸机俯冲（未投弹），持续火炮急袭5min。各型火炮、坦克、导弹、武装直升机集群连续发弹若干，期间暂停两次，各10min。演习结束，工兵排爆清理阵地后进场取回实验兔。伤后6h处死存活兔解剖，取脑组织标本，4%甲醛固定。
　　1.3脑组织病理检测取4%甲醛固定脑组织，石蜡包埋，切片行HE染色，光镜下观察形态学变化，由同一病理医生采用盲法评价。观察脑组织结构层次是否完整，神经细胞肿胀、变性、坏死，间质出血、水肿等情况。
　　1.4脑组织NMDA-R1免疫组化表达的测定取4%甲醛固定脑组织，石蜡包埋，连续切片（4μm），每例标本切5张免疫组化染色用。采用改进型SP法进行免疫组化染色，严格参照试剂盒说明操作。试剂盒型号，购于XX公司。每次染色时均用已知阳性切片作阳性对照，用PBS（磷酸缓冲液，0.01mol/L，pH值7.2）代替一抗作阴性对照。NMDA-R1表达均位于胞质和胞核内，表现为浅黄、棕黄或棕褐色。用半定量法评估其染色，无阳性细胞数为（-），阳性细胞数25%以下为（+），25%～50%为（++），51%～75%为（+++），超过75%为（++++）。
　　2结果
　　2.1兔一般情况各组实验兔均无直接火力命中。与空白对照组比较，反角隐蔽组实验兔全部存活，部分精神萎靡，反应迟钝，伏地，少部分耳道出血。因弹着点不规律，迎面隐蔽3组距离无差异，合并为1组。迎面隐蔽组18只实验兔当场死亡9只，至伤后6h取脑组织标本前再死亡3只，死亡率达66.7%（12/18）。剩余6只存活实验兔编为迎面隐蔽组，与另外两组同时刻点取脑组织进行病理形态学及组化检测，每只取五张切片进行组化表达强度及形态学观察研究。
　　2.2脑组织HE染色结果空白对照组脑组织切片HE显示，分子层，内、外颗粒层及锥体细胞层结构完整，均匀致密；锥体细胞数量丰富，胞体致密，核居中，轴突完整、干净，向四周延伸；间质为少量血管及白质，肌浆深染，胶质丰富，可见散在分布血管，腔内可见少量红细胞，未见炎症细胞（图1、图2）。反角隐蔽组脑组织切片HE显示，分层结构存在，锥体细胞数量减少，胞体稍肿胀，可见空泡变性，轴突断裂；细胞间少量红细胞分布，间质少量炎细胞浸润（图3、图4）。迎面隐蔽组脑组织切片HE染色显示，细胞结构层紊乱，分界不清，部分坏死，崩解；细胞数明显减少，胞体肿胀，体积增大，轴突消失，白质稀疏；间质充血，可见散在红细胞分布及浆细胞浸润（图5、图6）。
　　2.3脑组织NMDA-R1免疫组化的表达各组神经元锥体细胞中均有NMDA-R1表达，主要在神经元膜表面表达，免疫反应强度有差异。空白对照组可见神经元形态完整、胞膜淡染，NMDA-R1蛋白少量表达（+）（图7、图8）。反角隐蔽组可见神经元胞体肿胀，细胞数量减少，细胞膜典型黄染，NMDA-R1中量表达（++）（图9、图10）。迎面隐蔽组，可见大量神经元坏死崩解，残存神经元形态数量稀少，胞体肿胀，体积巨大，胞核溶解，大部分胞质、胞膜均黄染，色深，NMDA-R1大量表达（++++）（图11、图12）。迎面隐蔽组、反角隐蔽组NMDA-R1免疫反应强度均高于对照组，同时迎面隐蔽组NMDA-R1免疫反应强度亦高于反角隐蔽组。
　　3讨论
　　爆炸及爆炸应激性脑损伤是战争中人员遭受的一种多发而又严重的颅脑损伤，在美军近年的军事行动中，爆炸冲击波性脑损伤的发生率约为40%～60%，约有32万服役人员或战士遭受过爆炸冲击波脑损伤[5]，即使爆炸外围没有直接受到冲击波影响的战士，也因爆炸应激性损伤而导致脑组织及细胞发生相应的生理病理变化[6]。有报道显示[2]，HPA轴系统在应激反应调控中的作用与NMDA-R活化有着密切的联系。因此，为了了解爆炸及爆炸应激状态下脑组织损伤的病理生理机制，作者建立火炮打击兔应激防护模型，进行应激状态下兔脑组织病理变化及NMDA-R1表达的形态学研究。结果提示：与空白对照组比较，反角隐蔽组和迎面隐蔽组脑组织病理切片及免疫组化均可见脑细胞结构层紊乱，部分神经元变性、坏死、崩解，细胞数减少，胞体肿胀，体积增大，胞核溶解，细胞间质充血，浆细胞浸润等脑组织损伤的病理表现，并且迎面隐蔽组上述表现更明显和严重。同时，迎面隐蔽组脑组织NMDA-R1大量表达（++++），反角隐蔽组脑组织NMDA-R1中量表达（++），而空白对照组脑组织NMDA-R1少量表达（+），与脑组织病理损伤结果具有一致性。以上结果表明，NMDA-R1参与了爆炸及爆炸应激状态下脑组织病理损伤过程。