柯萨奇病毒与手足口病的研究进展

　　摘要：手足口病是以手、足、口腔等部位发生丘疱疹为主要特征的全球性急性传染病。柯萨奇病毒是手足口病感染最常见病毒，分为A和B两类，是经呼吸道和消化道感染人体的病毒，人感染初期会出现发热、打喷嚏、咳嗽等类似感冒症状。在诊断手足口病的过程中，除观察临床表现外，检测柯萨奇病毒作为一项重要参考指标，二者具有密不可分的联系。柯萨奇病毒检测手段也在不断的探索和研究当中得到了显著的提高。

　　关键词：手足口病；柯萨奇病毒；检测

　　手足口病多发生于学龄前儿童，尤以3岁以下儿童发病最高。患者和隐性传染者均为传染源，主要通过消化道、呼吸道和密切接触者等途径传播。主要症状表现为发热和手、足、口腔等部位的斑邱疹、疱疹。少数病例可出现脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎、肺水肿、循环障碍等，多由EV71感染引起，致死原因主要为脑干脑炎及神经源性肺水肿[1-2]。人体是否感染了柯萨奇病毒是诊断手足口病的一项重要参考指标。

　　1柯萨奇病毒流行病学特点

　　1.1传染源柯萨奇病毒和埃可病毒属于肠道病毒，在人群和自然界中广泛存在，主要经口传播，亦可通过呼吸道传播及经胎盘南母体传给胎儿。病毒经口侵入，继而入血，分布于多种器官引起多种不同的临床表现[3-4]。病毒存在于患者或带病毒者的咽部，还可以从患者的脑脊液、血液、心包液以及心肌标本中分离出某些型的柯萨奇病毒，有时在临床症状出现之前数天即能分离出病毒，在发病2w内排毒量最高。病毒感染主要引起手、足、口腔发生以小水疱为特征的传染性病毒疹，潜伏期4～7d，发疹前可有低热、头痛、咽通、食欲减退等前驱症状，尤以1～3岁小儿最多[5]。

　　1.2潜伏期、发病时间、排毒时间、感染后免疫时间。感染EV71更易导致重症HFMD，且重症患儿集中在3岁以下儿童；病毒载量与患儿病情无关；全年发病高峰期在第二季度[6]。即发病时间：在温带地区，柯萨奇病毒感染夏秋季节发病率相对较高，有研究显示，6～8月发病率最高[7-8]。

　　1.3易感人群及健康人群带毒率易感人群：人群普遍易感。人类任何年龄均可感染柯萨奇病毒。幼儿较成年人更易受到感染。CV感染6岁以下儿童多见。需要重视的是孕妇感染柯萨奇病毒容易被忽略。柯萨奇病毒隐性感染多见。在流行中，柯萨奇病毒隐性感染者比显性发病者多百倍以上。在人群中有一定水平抗病毒抗体，健康儿童中的带柯萨奇病毒率可以高达5%～50%。根据贾蕾、赵成松[9]等对108例患儿的肠道病毒总阳性率为97.2%（105/108），其中EV71、CA16、其他肠道病毒及EV71和CA16混合感染分别占51.9%（56/108），36.1%（39/108），1.9%（2/108），7.4%（8/108）。EV71感染患儿和CA16感染患儿两组间年龄、性别差异无统计学意义。单因素分析显示，CA16感染患儿口腔疱疹、膝部皮疹、流涕的发生比率高于EV71感染患儿.进一步多因素分析显示，出现膝部皮疹的患儿CA16感染可能性大。结论发现口腔无疱疹、膝部无皮疹、无流涕等症状的HFMD患儿时，应考虑EV71感染的可能。还有据我国北京地区统计资料，健康儿童粪便标本中柯萨奇病毒阳柯萨奇病毒A组多于B组[10]。有研究结果对不同血清型进行了分析：15岁以下儿童占A组病毒分离数的83%，B组病毒分离数的79%。其中0～4岁的病毒分离数占A组的62%，B组的54%。最常见的血清型为A9、A10、B3、B5[11]。

　　1.4柯萨奇病毒感染

　　1.4.1发病机制柯萨奇病毒是通过受体进入细胞的，主要的柯萨奇病毒受体是表皮紧密连接的一个成分，它是一个蛋白复合体，用来控制选择性的离子和分子通过表皮。CVB从表皮紧密连接进入极化的上皮细胞，引起短暂的紧密连接完整性的破坏。但CVB并不减少紧密连接的主要结构组织，而是刺激大量的胞饮小体（一种细胞紧密连接的完整独立成分）内化，也就是说CVB进入细胞依靠内体通过一系列的以细胞胞饮作用为特征的细胞内吞完成的。有研究认为微量元素在科萨奇病毒3感染中起着一定的作用。如青少年糖尿病的发生可能与肠道病毒包括科萨奇病毒3和微量元素相互作用有关。

　　通常人类感染柯萨奇病毒后24h，即可在患者咽部和小肠查出病毒，并在局部粘膜和淋巴组织中增殖，于感染后48～72h出现病毒血症，病毒随血流至全身各器官，病毒血症持续至头痛、恶心、呕吐、肌痛、皮疹等症状及体征出现后才消失。目前认为其引起皮肤损害的机制为在靶器官的毛细血管内直接释放或通过损伤细胞释放毒素物质而引起皮肤表现。

　　近年来对某些免疫相关性疾病的研究显示柯萨奇病毒感染是某些自身免疫反应的扳机。

　　柯萨奇病毒感染多显示有多变的宿主组织分布。在早期和近期的研究中，证实了病毒感染影响CYP基因在胰腺和肺内具有不同的表达，这种器官特异的基因表达能够解释病毒感染时宿主的多变的组织分布在老鼠中的研究认为NK细胞在病毒清除和宿主存活中有着重要的作用，但是人类的NK细胞在病毒清除中扮演如何作用确并不清楚。有研究显示在CVB3感染引起受感染的细胞中NK细胞受体配体表达，并且与细胞毒反应相比，IFN-γ的产生标志着更为早期的人类NK细胞的反应[11]。

　　1.4.2临床表现临床表现多种多样且轻重程度悬殊，以隐性及轻型感染居多，常见多器官多系统损害。最常见的症状是发热（90.8%）、咳嗽（52.0%）、腹泻（29.6%）、咽痛（22.4%），其次是胸闷心悸（13.3%）、一过性瘫痪（8.2%）、头痛、呕吐（7.1%）。常见的体征是肝、脾、淋巴结肿大（分别为31.6%、27.6%、17.3%），其次是皮疹（12.2%）、肺部干湿口罗音（11.2%）、咽部疱疹（10.2%）、口腔黏膜溃疡（7.1%）。实验室检查心肌酶升高最常见（CB2MB升高占27.6%，LDH升高占52%），其次是肝功能异常（ALT升高占16.3%，胆汁酸升高占22.4%）及末梢血发现异形淋巴细胞（19.4%），另外粒细胞减少（11.2%），尿检异常（14.3%）。19.4%有多器官多系统损害[12]。新生儿婴幼儿易多系统损伤，大龄患儿亦可出现多脏器多系统损伤。而萨科奇病毒（CBV）隐性感染对妊娠结局也有影响[13]。而感染柯萨奇病毒A组9型和16型常出现皮疹，多呈斑丘疹或风疹样皮疹，偶见水泡样疹。

　　近年来，国内外还陆续报道了人肠道病毒71型（EV71）感染暴发的流行.EV71感染除了引起手足口病以外，还能够引起脑干脑炎、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、急性迟缓性瘫痪、小脑共济失调等多种与神经系统相关的疾病，甚至发展为神经源性肺水肿、肺出血导致死亡，应引起临床工作者的高度重视[14]。全球CVB5可分为A、B、C、D共4个基因型，而引起无菌性脑膜炎暴发的CVB5属于基因型D，但位于不同的传播链中。

　　2柯萨奇病毒检测手段

　　2.1组织培养检出柯萨奇病毒：将患者体液或活检脏器组织标本，接种在猴肾、人胚肾、人羊膜等细胞中，进行组织培养以观察细胞病变，对于阳性标本需用不同型的免疫血清作中和试验进行类型鉴定，也可用电镜直接检查标本中的病毒颗粒，适用于病毒浓度高时。该方法的不足：组织培养相当耗时，而且不能普及。

　　2.2检测患者血清柯萨奇病毒特异抗体此方法是诊断柯萨奇病毒B组的首选方法。检测病毒抗体可以采用中和试验、血凝抑制试验、补体结合试验以及酶联免疫吸附法（ELISA）。目前国内广泛使用的是ELISA法检测.这一方法的实用中最大的缺点是标本需批量检测，出结果较慢。

　　2.3聚合酶链反应（PCR）技术聚合酶链反应（PCR）技术是近年发展起来的一种先进快速DNA体外扩增技术，它灵敏度高，特异性强，可检测特定序列的DNA片段，因而广泛应用于临床病毒性疾病的诊断，尤其是低拷贝数量病毒基因的分子诊断。逆转录柯萨奇B3（CoxB3）病毒，其可以在宫内感染，引起新生儿病毒性心肌炎。该病毒主要通过粪口传播、呼吸道传播及母婴垂直传播，可累积心肌。而RT-PCR法具有快速、敏感、特异性强等特点，是快速、有效检测CoxB3病毒感染的诊断方法之一。

　　2.4核酸杂交法有报道用柯萨奇病毒B组2型或3型全长RNA，经逆转录合成cDNA，再经缺口翻译制成探针，用32P或生物素标记，再与标本进行杂交，已用于检测心肌中的B组柯萨奇病毒。CV基因组间存在同源性，特别是非保守区核苷酸序列有高度同源性，这一点为核酸杂交诊断提供了理论依据。尽管从患者体内分离的病毒其抗原型每年都有变异，病毒所致疾病的临床特征也各有差异，但每一型病毒的基因组变异并不大；因此，发展快速的以核酸为基础的探针诊断方法很有前途。

　　2.5胶体金免疫层析检测技术20世纪80年代兴起的胶体金技术。以及最近报道的胶体金标记免疫层析技术作为一种新型的免疫学快速诊断和检测技术，具有微量、特异、简便、可单个标本检测，结果清晰易于判断。此方法也非常适用于柯萨奇病毒的检测。

　　2.6流式细胞分析技术采用IFA、RTPCR法观察了柯萨奇B组病毒（CBV）5型在Hep2细胞内的增殖动态。CBV感染细胞后4h可检出病毒RNA，8h可检出病毒抗原，12h可观察到细胞病变，20h可检出病毒颗粒。结果为CBV增殖特性的研究提供了新的资料，并指出PCR是监测CBV增殖的敏感方法。

　　柯萨奇病毒分成A、B两组，A组24型，B组6型，目前尚无有效疫苗生产。所以如何增强体质、切断感染途径非常重要。有研究表明，在人体缺乏硒及维生素E的情况下，柯萨奇病毒易产生点突变引起表型改变，使致病性增强。因此注意维生素及微量元素的补充，调节机体免疫功能，有益于防治柯萨奇病毒感染。同时，柯萨奇病毒感染以夏季多见，与其他季节相比有显著性差异。鉴于柯萨奇病毒等肠道病毒夏季高发，且易引起病毒性脑膜脑炎的暴发流行，应提高警惕，加强卫生宣教，提倡注意饮食卫生，医院需注意消毒隔离措施，降低院内感染的发生率，最大限度地避免肠道病毒感染的暴发流行。

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