结核分枝杆菌快速培养法的创新进展研究

　　摘要：结核病是全球关注的公共卫生问题和社会问题，也是我国重点控制的主要疾病之一，该疾病是由单一因素所致的感染性疾病，具有发病率高、死亡率高的临床特点，相关的研究资料表明，目前约有800万的新发结核病例，且有200～300万的死亡病例，全球约有1/3的人口受到不同程度的结核分枝杆菌感染，因此，采取有效的方式快速准确的诊断结核感染，及时进行化疗，防止其传播十分的重要。

　　关键词：结核分枝杆菌；快速培养法；创新；进展；研究

　　结核病的临床危害性较大，具有发病率高、死亡率大的特点，且近几十年来的发病率一直呈现逐步增长的趋势[1]。细菌学检查是发现传染疾病的重要途径和主要手段，对肺结核患者进行痰检验，发现其结核分枝杆菌是确诊肺结核疾病的主要方法，传统的涂片抗酸染色检查的阳性检出率较低，且较难分辨死菌和活菌，培养法的检出准确性较高，但是由于结核菌的生长速度较为缓慢，不利于患者的临床诊断和治疗[2]，因此，对结核分枝杆菌快速培养的方法进行创新和思考已成为临床热议的焦点，快速培养测定系统可有效缩短检测时间，且具有快速、灵敏、准确性高的特点[3]。本文就结核分枝杆菌快速培养法的创新进展，对噬菌体生物扩增法和结核分枝杆菌L型检测的培养概况进行了综述，现报道如下。

　　1噬菌体生物扩增法

　　1.1噬菌体的特性噬菌体包括真菌和古细菌，是原核生物病毒，又被称为细菌病毒。噬菌体的个体较小，可通过细菌滤器，且具有其他病毒共同的特性，噬菌体主要由蛋白质构成的外壳和包于其中的核酸组成，且不具有独立的代谢酶系，是一种专性的细胞内寄生菌，主要存活于活着并进行代谢的宿主细胞中，在该类细胞中进行生长和复制[4]。噬菌体感染细菌具有种属特异性，一个噬菌体只能感染一个细菌种属，有时也可感染一个种属的几株细菌，目前，噬菌体技术在各种细菌感染性疾病的诊断和治疗方面取得了十分成功的应用[5]。

　　1.2噬菌体生物扩增法简述噬菌体生物扩增法是指将噬菌体应用于快速检测结核分枝杆菌的技术，噬菌体D29可以感染生长缓慢的结核分枝杆菌，包括金色、偶然、胞内、草分枝杆菌等几种非结核分枝杆菌，检测结果通过快速生长耻垢分枝杆菌进行反映，噬菌体的增殖速度较快，在24h内，噬菌体浸染的细菌被裂解，进而形成无菌区域，如果继续培养不会继续增大，因此，可以以较快的速度反映标本中是否存在活的结核分枝杆菌，同时可用于检测抗结核药物的敏感性[6]。

　　1.3噬菌体生物扩增法的检测原理噬菌体D29在与结核分枝杆菌混合孵育时，可以对活的结核分枝杆菌造成感染，加入杀毒剂后，结核分枝杆菌体外的噬菌体灭活，且菌体内的噬菌体不会受到影响，噬菌体在菌体内大量的繁殖和裂解，进而释放子代噬菌体，噬菌体在感染和裂解后，进而与指示细胞发生反应，琼脂培养基可在指示细胞裂解后形成噬菌斑[7]，且噬菌斑的数目和标本内活的结核分枝杆菌数量呈正比的关系，但是如果标本中不含有结核分枝杆菌，那在经杀毒剂处理后，痰液中的无噬菌可以较好的存活。噬菌体生物扩增法检测后的18～24h可判读结果，小于等于10个噬菌斑为阴性，大于等于20个噬菌斑为阳性[8]。

　　1.4噬菌体生物扩增法的临床应用分析胡忠义[9]在《噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌方法学研究》一文中就建立噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌试验方法，探讨最佳检测条件这一目的进行了研究分析，应用分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，比较各种检测条件对测定结果的影响，并将所建方法用于痰标本检测，研究结果表明，与BIOTECLab公司产品比较，1×109噬菌斑形成单位（PFU）/ml的噬菌体，37℃感染60min可检出200～500条/ml结核分枝杆菌，杀毒剂100mmol/ml，室温作用5min可完全灭活受试噬菌体，指示细胞浓度在1×108条/ml时，形成的噬菌斑清晰。4种非结核分枝杆菌（偶然、胞内、金色、草分枝杆菌）在高浓度时（>1×105条/ml）检测结果为阳性，重复试验结果表明，本法批间和批内变异系数均<15%。痰标本氢氧化钠-半胱氨酸液化方式的阳性检出率为94%（49/52），显著高于氢氧化钠液化结果的62%（32/52，χ2=15.06，P<0.01）；预培养1d的阳性检出率为65%（51/78），显著高于未预培养结果的40%（31/78，χ2=18.05，P<0.01）。最终得出"噬菌体生物扩增法快速、简便、灵敏，有助于结核分枝杆菌的快速检测"这一结论。

　　1.5噬菌体生物扩增法的应用局限性噬菌体D29可以对生长较为缓慢的结核分枝杆菌造成感染，且可以有效感染耻垢、金色、偶然、胞内等几种非结核分枝杆菌[10]，但我国的非结核分枝杆菌较为少见。噬菌体生物扩增法的操作影响因素较多，实验操作过程较为复杂，实验过程中需设立阳性和阴性对照，以确保结果的可靠性，且噬菌体在痰液成分的保护下可能逃避清除，在60℃的温度下，作用1min就有可能灭活，因此，需注意浇注器皿的温度不宜过高[11]。

　　2结核分枝杆菌L型检测

　　2.1结核分枝杆菌L型检测概述国外研究资料表明[12]，在体内外多种因素的影响下，结核分枝杆菌可发生形态的异变，主要表现出细菌细胞壁完全或部分缺失，这部分变异的细菌在医学上被命名为"L型菌"，在药物诱导及免疫因子作用和自身生活周期中，非结核及结核两种分枝杆菌容易在细胞壁丢失的影响下，形成分枝杆菌L型，临床上也将该细菌称为细胞壁缺陷菌，细胞壁缺陷菌由于细胞壁的缺乏或者不完整，分枝菌酸或者磷脂容易全部缺失，因此，常规的抗酸染发检测不容易着色或者着色极淡。除此之外，结核分枝杆菌L型菌的菌体渗透压较高，在等渗的普通培养基上溶解容易被破坏，导致采用普通结核分枝杆菌检测容易呈现阴性结果。结核分枝杆菌L型检测具有快速简便、灵活性高的优点[13]。

　　2.2结核分枝杆菌L型检测的临床应用结核分枝杆菌的细胞壁脂质含量较高，约占总比的60%左右，且大部分的分枝菌酸包围在肽聚糖层外面，对染料的穿入造成了较大的影响。常规的抗酸染色可较好的用于分枝杆菌L型的检测中，但是因为结核分枝杆菌L型对染料的拒染力较强，因此染色结果常为阴性，容易导致漏诊及误诊情况的出现，但结核分枝杆菌L型检测的灵敏度较高，特异性较强，因此可用于痰结核分枝杆菌的常规检测中[14]。赵丹[15]学者在《结核分枝杆菌L型检测对结核病诊疗价值的研究》一文中通过探究评价MTB-L涂片染色方法的改进及其方法学，得出"MTB-L抗酸染色方法具有良好的灵敏度、特异度，操作简便易行，适合于痰MTB-L常规检测，能够在基层结核病实验室推广应用"这一结论，进一步佐证了本文的观点，具有较好的临床借鉴价值。

　　3小结

　　快速培养法具有操作简单、特异度高、敏感性高的临床优越性，因此，可在临床中应用和推广，噬菌体生物扩增法和结核分枝杆菌L型检测可在结核分枝杆菌快速培养法中得到良好的应用。

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