牛黄清感胶囊对甲型H3N2流感病毒抑制和预防作用的实验研究(2)

　　2.1.2病毒MTT染色法

　　观察细胞病变CPE结果后，加入MTT5mg/mL，每孔10μL，置37℃培养4h，然后加入100μLDMSO有机溶剂，室温20min，充分溶解细胞（过程中稍加震荡）。然后，采用酶标仪波长570nm测定，记录OD值，计算药物半数有效浓度IC50和最小有效浓度MIC及治疗指数TI，判断药效。实验重复3次。

　　2.2牛黄清感胶囊对甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的预防作用

　　2.2.1病毒CPE法

　　2.2.1.1细胞培养按2.1.1.1的方法。

　　2.2.1.2药物作用细胞牛黄清感胶囊，选用对细胞的最大无毒浓度（TD0）2倍稀释8个浓度，即750～5.9μg/mL，同时设利巴韦林注射液阳性药物对照，2倍稀释9个浓度1000～3.9μg/mL，每浓度接种感染细胞3孔，每孔100μL。实验分1次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞1次），3次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞，每24小时弃掉旧药液，换同浓度的药液，连续3次）。

　　2.2.1.3病毒攻击将100TCID50甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒（采用病毒生长液（D-MEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5mL、青酶素100U/mL、链酶素100μg/mL，HEPES12.5mL，TPCK-胰酶0.5mL）稀释后，接种经药物作用的MDCK细胞96孔培养板，每孔100μL，同时设病毒对照（100TCID50病毒液），设正常细胞对照。36℃、5%CO2孵箱中吸附2h，弃掉病毒稀释液，采用Hank's溶液洗2次。

　　2.2.1.4细胞培养及观察每孔加入100μL病毒生长液，36℃、5%CO2孵箱培养，每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化，按2.1.1.3的指标判断药效。实验重复3次。

　　2.2.2病毒MTT染色法

　　按2.1.2的方法。

　　3实验结果

　　在MDCK细胞培养内，采用病毒细胞形态变化CPE法、MTT染色法，检测不同浓度的牛黄清感胶囊对甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的预防作用。实验分1次用药组和3次用药组，用Probit回归法计算计算药物的半数有效浓度IC50，最小有效浓度MIC及治疗指数TI。3次实验结果见表2。

　　4讨论

　　流行性感冒一直是世界高发的传染病之一，每年全球约有6亿人患流感，占总人口的10%。我国是世界上公认的流感多发地甚至是发源地，其机制尚不清楚。其中曾经引起世界性大流行的A（H3N2）亚型流感病毒自1968年以来一直在人群中存在[2]。流感病毒的抗原变异与流感的发生和流行密切相关，流感病毒正是通过不断改变其抗原性来逃避宿主特异性免疫的识别和清除，从而不断引起流行[3-4]。

　　国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药研发的一个热点[5]。牛黄是一种常用的名贵中药，味苦、甘，性凉。归心、肝经。具有清心解毒、凉肝息风、豁痰开窍等功效。现代药理学方法研究结果显示，生物牛黄中间体在鸡胚成纤维细胞上使新城疫系疫苗毒的TCID50升高1个滴度[6]。金银花具有清热解毒，凉散风热之功效，有研究[7]发现金银花具有明显的抗病毒作用，其有效活性成分为绿原酸类化合物，金银花的抗病毒