禽流感免疫抗体效价检测

　　摘要：为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解乌鲁木齐市米东区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区不同鸡场进行了禽流感抗体检测。结果表明，40只免疫鸡，免疫抗体效价合格数33只，总合格率为82.5%。说明近几年对高致病性禽流感采取的强制免疫措施达到了比较显著的效果。

　　关键词：禽流感；免疫；抗体效价；血凝试验；血凝抑制试验

　　中图分类号：S855文献标识码：B文章编号：1007-273X（2013）07-0029-02

　　禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）定为A类传染病。禽流感病毒感染后，呈现出较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。禽流感病毒不仅能引起禽类严重的疾病，而且对人类和哺乳类动物也能造成感染。在世界各种家禽和野生禽类中，按照血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面抗原来区分，已发现了数千种属于许多不同抗原亚型的病毒。各种品种和不同日龄的禽类均可感染高致病性禽流感。该研究为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解本地区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区鸡场进行了禽流感抗体检测，并对不其检测结果进行了对比分析。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1试验动物40只鸡由米东区铁厂沟镇大草滩村养禽场提供。

　　1.1.2试剂禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原，禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验阳性血清，1%鸡红细胞悬液。

　　1.1.3仪器96孔V型微量反应板、台式离心机，单道、多道微量可调移液器，吸嘴，微量振荡器，加样槽。

　　1.2方法

　　1.2.1血凝（HA）试验在微量反应板的1～12孔均加入0.025mL的PBS，换滴头，吸取0.025mL病毒悬液加入第1孔混匀，从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，依次倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头，每孔再加入0.025mLPBS。每孔均加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液，充分混匀后加入。在微量振荡器上振荡2min，在25℃恒温箱内静置40min后观察结果。

　　1.2.2血凝抑制（HI）试验在微量反应板的1～11孔加入0.025mL的PBS，，第12孔加入0.05mL的PBS，吸取0.025mL被检血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。1～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温25℃静置30min。每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，在室温25℃静置40min，对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。灭活疫苗的免疫效果以抗体效价≥4log2时，判定为免疫效力良好；<4log2时，判定为免疫效力较低，应当进行免疫接种。

　　2结果与分析

　　2.1血凝（HA）试验结果

　　将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌，完全血凝的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。本试验中抗原的血凝效价为1：128。

　　2.2血凝抑制（HI）试验结果

　　以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有当抗原对照孔（第11孔），红细胞对照孔（第12孔）阴性血清对照都成立时，试验结果才有效。被检测的40份鸡血清样品中，抗体监测结果其抗体效价≥4log2的样品有33份，合格率达82.5%。鸡群经过几次接种免疫后，抗体保持了较高的水平，与反复免疫产生的免疫应答和免疫记忆有关。

　　3小结与讨论

　　3.1免疫效果影响因素

　　免疫抗体水平的高低与疫苗的质量、保存管理、疫苗免疫剂量、免疫操作技术、营养状况、母源抗体水平、遗传因素等都有关。在免疫时应严格把管好质量，对保存不当、过期和失效的疫苗坚决废弃。在接种疫苗时确保每只鸡都能接种到一定剂量的疫苗及要严格遵守接种疫苗时所应遵守的原则，接种后还要注意观察鸡群的反应情况。

　　3.2试验器材的选择和使用

　　微量反应板。单道和多道微量移液器，吸头等都会影响HI试验的准确性。微量反应板有U型和V型两种，V型板产生的凝集图像清晰，易于判定，因此一般使用V型板，最好是一次性96孔V型微量反应板。单道、多道可调微量移液器在使用时需注意：一是吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防容液吸取过快，冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气；二是取样时只需按到第一档，停点排样时需按到第二档停才能彻底排出，以达到吸取的量准确。吸头的型号和规格需一致，否则会导致加样量不一致。

　　3.3缓冲液的配制

　　试验中使用的稀释液的pH对本试验有影响。稀释液的pH在5.8以下时，红细胞易自凝；pH在7.8以上时，凝集的红细胞洗脱加快，而pH7时红细胞沉淀最充分，图形清晰。此外，缓冲液对其他酸碱物质具有一定的缓冲能力，有维持反应体系pH的作用。使用pH7.2的PBS比使用生理盐水作稀释液效果好。

　　3.4血清稀释时的混合程度

　　稀释血清时混合不均匀，会使结果出现差异。用微量移液器吹打时，V型孔内和吸头内都易产生气泡，使得稀释不充分，而且稍不小心，孔内的液体就会溅出，影响检测结果的准确性。所以稀释血清时应避免产生过多的气泡及液体溅出。