洋葱ANS基因启动子的克隆与瞬时表达分析

　　摘要：通过PCR方法对洋葱花青素合成酶基因（AcANS）上游启动子序列进行扩增，获得长度为18kb和22kb的两种片段，命名为ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明，克隆到的两个启动子除含有多个TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件，还含有与MYB转录因子结合的元件，以及参与光响应、逆境、激素应答的顺式作用元件。同时构建ANSPM1和ANSPM2驱动GUS报告基因的植物表达载体，通过洋葱表皮细胞瞬时表达分析，表明两个启动子均有活性。

　　关键词：洋葱；花青素合成酶基因（ANS）；启动子；克隆；瞬时表达

　　中图分类号：Q785；Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）05-0013-05

　　洋葱（AlliumcepaL）又称球葱、圆葱、玉葱、葱头，二年生草本植物，百合科葱属，是人们喜食的蔬菜。近些年人们更多地将洋葱作为一种保健食品，因为洋葱是富含类黄酮物质的蔬菜之一。

　　类黄酮是高等植物水溶性次生代谢产物，主要包括6类化合物：查尔酮、黄酮、黄烷双醇、黄酮醇、花青素和原花色素[1]。已有研究指出，类黄酮具有抗氧化[2]、降低心血管疾病及癌症风险的功能[3]。

　　花青素是一类重要的水溶性天然植物色素，属于类黄酮物质，在植物体中广泛分布。作为一种天然的食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有重要的营养和药理作用[4]。自然条件下游离的花青素极少见，常与一个或多个葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色素苷。花青素合成酶（ANS）是位于花色素苷合成通路末端的酶，催化无色花色素向花色素的转化[5]。自1990年Messen等利用转座子标签技术从玉米中分离了ANS基因后，学者们又先后在美国金钟连翘（Forsythia×intermedia）[6]、紫苏（Perillafrutescens）[7]、芜菁（BrassicacampestrisLssprapa）[8]、紫菜薹（Brassicacampestrisvarpurpuraria）[9]、紫苤蓝（Brassicaoleraceavarcaulorapa）[10]等植物中克隆了ANS基因，本课题组对AcANS基因进行了克隆和序列分析[11]，本研究即在此基础上展开。

　　高等植物基因的表达调控是分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要组成部分。深入研究启动子的结构和功能，可利用基因工程技术对植物转基因表达进行调控。为探索洋葱ANS基因在转录水平上的表达调控机制，本实验克隆了洋葱ANS基因启动子并对其调控元件、结构及功能进行分析。

　　1材料与方法

　　11植物材料与菌种

　　洋葱材料、野生型拟南芥种子由本实验室提供。洋葱鳞茎采自山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地，取样后迅速用液氮速冻后于-80℃保存，用于洋葱基因组DNA的提取。

　　大肠杆菌（Ecoli）菌株TOP10购自天根生化科技（北京）有限公司。根癌农杆菌LBA4404菌株及植物双元表达载体pBI121由本实验室提供。

　　12试验试剂

　　ExTaqDNA聚合酶、dNTP、pMD18-T试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、DNAMarkerDL2000均购自TaKaRa公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。引物由博尚生物技术有限公司合成，见表1。测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。