龙凤湿地水体对霍夫水丝蚓DNA损伤的研究

　　大庆市龙凤湿地自然保护区位于大庆市龙凤区东南，东经125°07′-125°15′，北纬46°28′-46°32′，距市中心仅8km，由乌裕尔河下游流域永久性及季节性淡水沼泽地和小型潜水湖组成。自然保护面积约为5996hm2，核心面积为3085.07hm2，缓冲区面积为609.56hm2。龙凤湿地是鸟类重要的繁殖地和迁徙的中继站，有野生动物207种，其中鸟类有76种，有丹顶鹤、东方白鹳、大鸨等5种国家一级保护鸟类；有大天鹅、灰鹤、鸳鸯等19种国家二级保护鸟类；有大白鹭、青头潜鸭等19种省级重点保护鸟类。另外，龙凤湿地还有鱼类45种，维管束植物314种[1]。龙凤湿地是大庆油田和石油化工的滞洪区，在发挥防洪、滞洪功能的同时，还起着调节城市的小气候、增加空气温度、滞留与降解自然来水中的有害物质、美化环境、丰富市民生活的作用。
　　1984年，Ostling首创了单细胞凝胶电泳技术（Singlecellgelelectrophoresis，SCGE），随后Singh将方法加以完善，形成一种快速检测单细胞DNA损伤的方法[2]。单细胞凝胶电泳通过对培养动物的细胞悬液进行电泳，从而检测其DNA损伤，具有灵敏度高、迅速、简便、经济以及所需细胞少等优点。近年来，单细胞凝胶电泳技术广泛应用于环境毒理学检测、细胞凋亡研究、疾病的预防与检测等领域[3]。霍夫水丝蚓（Limnodrilushoffmeisteri）属环节动物门寡毛纲近孔目颤蚓科水丝蚓属，生活于污染较重的水域，如含有机质、腐殖质较多的污水沟、排水口等处。霍夫水丝蚓对环境条件的变化特别敏感，常被作为环境监测的指示动物[4]。本研究利用龙凤湿地不同浓度梯度（100%﹑95%﹑90%﹑85%﹑80%）的水样培养霍夫水丝蚓，通过单细胞凝胶电泳试验检测霍夫水丝蚓细胞内DNA的损伤情况，研究龙凤湿地水体对霍夫水丝蚓的遗传毒性效应，进而对龙凤湿地水体毒性进行监测，为龙凤湿地水污染防治和环境保护提供基础资料。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　1.1.1动物霍夫水丝蚓购自大庆市让胡路农贸花鸟鱼市场。
　　1.1.2仪器Nikon80i型荧光显微镜、DYY-6C+DYCE-27型电泳仪、DF-101S型集热加热式磁力搅拌器、TGL-16M型高速台式冷冻离心机、Eppendorf微量移液器等。
　　1.2方法
　　1.2.1水样的处理按照《中华人民共和国国家环境保护标准》中关于天然水样采集规定操作[5]。选择3个样点，分别标示为A、B、C样点。用采样桶每月采样一次。采回的水样于4℃保存备用。
　　1.2.2霍夫水丝蚓的培养在15～18℃条件下将霍夫水丝蚓培养于大培养皿中，每天清洗一次，2～3d后选取长度相对一致的霍夫水丝蚓为试验动物。分别设试验组和对照组，EMS培养液作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。
　　1.2.3急性毒性试验将水样用8层纱布过滤，用蒸馏水将过滤后的水样配制成质量分数分别为80%、85%、90%、95%、100%的水样培养液，各取50mL倒入培养皿中。每组各随机加入长度相近的霍夫水丝蚓30条，培养3h，温度控制在20～22℃。霍夫水丝蚓中毒后死亡的症状主要表现为身体泛白、失去伸缩能力、用解剖针碰触完全无反应则为死亡[6]。
　　1.2.4单细胞凝胶电泳试验
　　1）单细胞悬液的制备。将染毒恢复后的霍夫水丝蚓取出，吸干水分，放入装有缓冲液的研钵中充分研磨。将研磨液用200目尼龙网过滤、离心，吸取上清液。反复冲洗离心，取上清液。滤液即为霍夫水丝蚓单细胞悬液。
　　2）DNA损伤测试。按照《现代环境生物学实验技术与方法》中单细胞凝胶电泳技术操作[7]。
　　1.2.5数据分析选择有代表性的20个拖尾细胞，切换到图像分析软件窗口进行彗星测量、分析[8]。使用SPSS10.0软件和CASP软件进行统计学分析。
　　2结果与分析
　　2.1A样点水样对霍夫水丝蚓DNA的损伤
　　从图1可以看出，当龙凤湿地A样点水样稀释为80%～85%浓度时，DNA损伤程度比较小，而当浓度达85%以上时曲线斜度急速增大，表明霍夫水丝蚓DNA损伤加大。
　　2.2B样点水样对霍夫水丝蚓DNA的损伤
　　由图2可知，当龙凤湿地B样点水样稀释为80%～85%浓度时，DNA损伤程度比较小，而当浓度达90%以上时，曲线斜度急速增大，说明DNA损伤加大，其原因可能是污水浓度太大，严重影响霍夫水丝蚓DNA的复制，使DNA变异，产生严重的损伤。
　　2.3C样点水样对霍夫水丝蚓DNA的损伤