基于ITS2条形码的桔梗药材遗传多样性研究

　　[摘要]目的：利用ITS2条形码探讨不同产地桔梗的遗传多样性。方法：提取桔梗药材DNA， PCR扩增基于进化速率较快的DNA内部转录间隔区2（ITS2）序列并测序，采用Clustal比对分析不同产地桔梗ITS2序列，应用MEGA 5.05软件计算种内Kimura 2parameter（K2P）遗传距离，以桔梗科党参属植物党参的ITS2序列为外展值，运用邻接法（neighborjoining method）构建桔梗系统进化树。结果：试验所用全部样本的K2P遗传距离为0～0.930，相同地区来源的样本K2P遗传距离分布于0～0.178，不同地区来源的样本K2P遗传距离为0.735～0.930；分析结果表明，桔梗种内遗传变异程度巨大，与其地理位置显著相关。结论：ITS2条形码适用于桔梗种内遗传多样性研究，为进一步拓展DNA条形码技术的应用提供了参考。
　　[关键词]桔梗；ITS2条形码；遗传多样性
　　桔梗为常用中药之一，来源于桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum （Jacq. ） A. DC. 的干燥根，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓之功效，用于治疗咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑、肺痈吐脓等症[1]，现代药理学研究表明，桔梗还具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血脂等生物活性[25]，也是朝鲜族传统的咸菜食品之一。桔梗属植物全世界仅1种1变种，即桔梗及其变种白花桔梗P. grandiflorum （Jacq. ） A. DC. var. album Hort.[6]。桔梗在我国大部分省区均有分布，分布范围跨度大，其遗传背景复杂，遗传分化差异显著[7]；同时，作为药材和食材，桔梗已有近50年的栽培历史[8]，目前桔梗药材也以栽培品为主。《中国药典》规定“按干燥品计算，含桔梗皂苷D （C57H92O28） 不得少于0.10%”，而文献报道不同产地桔梗药材中皂苷含量存在着较大的差异[9]，推测这种差异当与不同产地桔梗的遗传分化、栽培用种的复杂种源以及生境差异有密切关系，探讨这种关系对于桔梗优良品种选育、规范生产用种、提高和稳定桔梗药材质量具有重要的意义。DNA条形码是近年来兴起的一种用短而标准的DNA片段对物种进行快速、准确鉴定和识别的方法[1011]。ITS2作为DNA条形码之一，由于其具有通用性强及扩增效率和成功率高的优点，已广泛应用于物种分类与系统进化、药材真伪鉴别、药材基原探索等研究[1117]。笔者采用DNA条形码的ITS2序列，对不同产地桔梗种质的遗传变异及其亲缘关系进行了探讨。
　　1材料与方法
　　1.1材料于2013年5月至2014年3月，从内蒙古、安徽、浙江、四川、重庆等8省区市收集栽培桔梗药材样本29份，经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为桔梗P. grandiflorum。供试材料来源信息及试验所得序列的GenBank登录号见表1。
　　1.2DNA提取和PCR扩增采用改良CTAB法提取桔梗药材总DNA[18]。使用植物ITS2区通用引物（正向引物5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′，反向引物5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT3′）进行PCR扩增[19]。PCR在MJPTC200 PCR仪上进行，扩增程序为94 ℃预变性5 min，然后进行25个循环：94 ℃变性30 s，59 ℃复性45 s，72 ℃延伸45 s，循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存扩增产物。扩增反应采用30 μL体系，包括模板DNA 3 μL（10 mg·L-1）、正向引物和反向引物各0.6 μL （10 μmol·L-1） ，2×Taq MasterMix 15 μL，去离子超纯水10.8 μL。委托上海生工生物工程股份有限公司对PCR产物进行测序。
　　1.3数据分析应用ContigExpress软件对测序峰图进行校对拼接，获得ITS2序列。使用的Clustal W（Version 2.1）软件对试验所得序列进行同源性比对。利用MEGA（Version 5.05）软件寻找SNP位点，运用K2P（Kimura 2Parameter）模型计算各样本之间的种内遗传距离，采用邻接法构建系统聚类树。
　　2结果与分析
　　2.1ITS2序列分析本试验中29个样品的ITS2序列平均长度为500 bp，序列GC量56.46%～60.60%，平均为59.60%，其差异较小。对样本进行种内K2P遗传距离计算，其数值分布于0～0.930，多组相同地区来源样本的种内遗传距离为0～0.178，而不同地区来源样本的遗传距离在0.735～0.930，该结果表明，桔梗种内遗传变异程度巨大，与其地理位置显著相关；同时，根据笔者对桔梗生产状况的调查，目前各地栽培桔梗多自行引种，种源来源复杂，可能也是不同产地桔梗遗传背景复杂的重要原因之一。
　　2.2遗传聚类分析基于试验所得ITS2序列，以桔梗科党参属植物党参Cononopsis pilosula（Franch.） Nanf.的ITS2序列（GenBank登录号 KF030458）为外展值，采用邻接法构建的系统聚类树显示：29个样本大致聚为2大类，其中第16，22，15，11，10，14，17，3，2，23，1，20，19，18，4，5，21，24号样本构成第一大类，第12，25，13，6，7，8，9，26，27，28，29号样本构成第二大类。29份样本大致按照地理分布来聚类，总体上来源地相同的样本聚类在一起，但其中也有差异，例如1，2，3，22，23，24等6个来源于四川省的样本并不严格聚类在一起，其遗传距离为0.095～0.178，提示种植地生态小环境对桔梗种质遗传变异的影响较大，但可能也与各地桔梗栽培用种种源来源不同有关，见图1。
　　3讨论
　　3.1桔梗的遗传多样性据全国中药资源普查的统计，桔梗在我国24个省区市的600余个县均有分布，属于广布种[8]。本研究中，桔梗样本的聚类结果与地理分布基本一致，表明同一地区相同生境的桔梗的遗传变异相对稳定。严一字等[20]对56份来源于不同国家和地区的桔梗种质资源进行了RAPD分析，得出了类似的结论。