溶氧对多粘芽孢杆菌发酵影响的研究(2)

　　从斜面上接一环菌到摇瓶种子培养基中，28 ℃，200 r/min下培养至对数期后期，以5%接种量接入30 L发酵罐（上海保兴公司），装料20 L，罐压0.02 MPa，在发酵过程中通过空气流量及搅拌转速控制对溶氧进行控制，因为加入了碳酸钙，故pH不予控制。

　　1.4  补料发酵研究

　　装料20 L，罐压0.02 MPa，转速300 r/min，空气流量1 vvm，配制60%的葡萄糖补料液，后面根据溶氧要求灵活的控制补料速率直至芽孢形成。

　　1.5  分析方法

　　1.5.1  溶氧测定  梅特勒溶氧电极在线测定。

　　1.5.2  菌丝浓度测定  Eppendorf 台式离心机5 000 r/min离心10 min。

　　1.5.3  芽孢数测定  活菌数按常规平板计数法测定[5]，检测芽孢数前，将菌液在80 ℃预处理20 min，再按照常规平板计数法测定[6，7]。

　　1.5.4  抗生素含量测定  首先将发酵液直接冻干成粉末，采用甲醇萃取，萃取液采用HPLC测定，条件：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.01 mol/L三氟乙酸-乙腈，从77.0%～75.5%二元梯度洗脱;流速为1.0 mL/min;紫外检测波长为205 nm;进样量为20 μL;柱温为30 ℃。

　　2  结果与分析

　　2.1  多粘芽孢杆菌临界氧浓度的确定

　　多粘芽孢杆菌菌体浓度进入稳定期之后，突然停止通气，观察溶氧电极指数的变化。由图1可知，刚开始溶氧直线下降，而当其降到约20%时，下降速率变小。这说明溶氧为20%以下时，多粘芽孢杆菌的呼吸会受到影响，也表明该菌是一个极度高耗氧微生物，溶氧对其影响非常大，20%的溶解氧浓度是该菌的生长临界溶解氧浓度。

　　2.2  不同溶氧下多粘芽孢杆菌发酵的动力学特征

　　图2表明刚开始接种的15 h内，发酵液中溶氧浓度较高，有利于菌体的生长。随着发酵时间的延长，过高溶氧浓度并不利于多粘芽孢杆菌菌体的生长。数据显示最佳溶氧是40%，该条件下菌体浓度可以达到最高，为42%。而由图3可知，不同溶解氧浓度也影响几种代谢产物多粘菌素和杀镰孢菌素等的生成速率及最终发酵液中它们的含量。图3显示溶氧为40%的情况下抑菌物质生成速率均要大于其他两个溶氧浓度下的生成速率，并且该溶氧条件下抑菌物质的最终浓度要大于其他条件下的最终浓度。

　　2.3  不同溶氧下多粘芽孢杆菌芽孢形成的比较

　　这里考察了不同溶氧对多粘芽孢杆菌芽孢形成的影响，当42 h发酵结束时，测定芽孢数，计算芽孢形成率。从表1中可以得知，当溶氧为40%时，芽孢形成率最高，同时由于该条件下菌体浓度最高，所以形成的芽孢数也是最多的。

　　2.4  利用补料技术控制多粘芽孢杆菌发酵过程中的溶氧

　　由于前面试验已经证明了该菌是一个极度高耗氧微生物，而在分批的情况下碳源已经全部加入了培养基，这就导致分批发酵时的溶氧不会很好，只能在非常高的转速下（700 r/min以上）才能达到比较好的溶氧效果，但是这样的培养条件不利于放大。为此笔者采用补料分批的方法流加碳源， 以提高发酵过程中的溶氧， 达到提高芽孢数和抑菌物质产量的目的。当溶氧上升时开始补料，灵活的控制补料速率保存溶氧在40%波动， 结果（表2）表明补料发酵确实能提高产品的芽孢数和生物活性物质的产量。