氯氰菊酯降解菌DZS—3的分离鉴定及其特性(2)

　　1.2  方法

　　1.2.1  氯氰菊酯降解菌的分离纯化  称取污泥5 g，加入灭菌的装有100 mL去离子水的三角烧瓶中，170 r/min、30 ℃，在摇床上振荡1周，充分释放污泥中的微生物[4]，然后将上清液5 mL和曝气池液体5 mL加入到含氯氰菊酯浓度为50 mg/L的100 mL液体基础培养基中，在摇床上30 ℃、170 r/min培养。按3%的接种量，每7 d转接1次，每转接1次氯氰菊酯浓度提高50 mg/L，直到氯氰菊酯浓度为250 mg/L。交替使用乙醇和正己烷溶解氯氰菊酯以消除溶剂对试验的干扰，确保筛选出的菌株能够利用氯氰菊酯农药作为惟一碳源、氮源生长。取菌液按100，10-2 ，10-4，10-6 进行做4个梯度的稀释（每个梯度设3个重复）后涂布于含氯氰菊酯的固体基础培养基平板上，于30 ℃培养箱中培养。待长出菌落后，按照菌落形态、大小、颜色不同挑取单菌落在含氯氰菊酯的固体基础培养基平板上划线分离，纯化菌株，直到得到单一、均匀的单菌落。

　　1.2.2  紫外分光光法初步鉴定高效降解菌株  将筛选得到的生长良好的单菌落接入3 mL液体富集培养基中，30 ℃、170 r/min摇床过夜培养。按3%的接种量将过夜培养的菌液转接到含100 mL富集培养基的三角瓶中，培养至OD600 nm=0.6左右，7 000 r/min、5 min离心收集菌体。并用磷酸缓冲液洗两次。用磷酸缓冲液悬浮菌体，并调OD600 nm=1.0。按3%的接种量接种到5瓶10 mL的液体基础培养基中（氯氰菊酯浓度为100 mg/L）培养，以不加菌为对照，1、3 d 取样，每个样做3个重复，以三氯甲烷为萃取剂双倍体积萃取。三氯甲烷萃取后用紫外可见分光光度计于200～700 nm波长下扫描确定氯氰菊酯的特征吸收峰，检测氯氰菊酯的降解情况，以确定降解效果最好的菌株。

　　1.2.3  高效降解菌株降解率的确定  将降解效率最高的菌株按与“1.2.2”基本相同的步骤操作，其中氯氰菊酯的含量为10 mg/L，取样点为1 、3 、5 、7 、9 d。最后用环己烷双倍体积萃取氯氰菊酯，无水硫酸钠除去样品中的水，每个样做3个重复，用气相色谱检测氯氰菊酯的含量。

　　气相色谱条件[5]：气相色谱仪为7 890A（带工作站），载气：99.999%N2，平均线速度：65 cm/L，不分流进样，进样量为1 μL ，毛细管柱（30 mm×0.53 mm× 1.5 μm）。进样口温度为250 ℃，ECD检测器，检测器温度为300 ℃，柱温采用程序升温：初温为150 ℃升温至280 ℃，在此温度保持10 min。

　　1.2.4  高效降解菌生长曲线的绘制  将对氯氰菊酯降解率最高菌株富集后按1%的接种量接种到含0.01%的Yeast extract的液体基础无机盐培养基中，30 ℃、170 r/min培养，0、1、3、5、7 、9 d取样，测定其相应的OD600 nm，以培养时间为横坐标，菌液OD600 nm为纵坐标，绘制生长曲线。

　　1.2.5  氯氰菊酯降解菌的鉴定

　　1）染色。常规染色观察菌株的形态学特征，革兰氏染色检测参照文献[6]。

　　2）16S rDNA序列系统发育分析。将菌体接种到富集培养基中培养过夜，取100 μL菌液离心，用灭菌水洗两遍，再用100 μL灭菌水悬浮菌体，沸水中煮10 min，再放置冰上5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清作为模板直接PCR。

　　PCR反应体系（25 μL）：rTaq 酶（5 U/μL） 0.2 μL，10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上清液 2 μL，上游引物 0.3 μL，下游引物 0.3 μL，灭菌水 17.7 μL。

　　PCR反应条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min30 s，30个循环;72 ℃ 8 min。

　　将PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，将条带单一，清晰的PCR产物切胶回收。将回收片段与pGEM–T Easy载体于4 ℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。随即挑取几个转化子抽提质粒，酶切检测。将含有目的条带的转化子送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

　　3）生理生化鉴定。为明确菌株的生理生化特性，对菌株作了以下试验：碳源利用试验，产酸试验，产H2S试验，淀粉水解试验，甲基红试验，明胶液化试验，V.P.试验，吲哚试验。试验方法参照文献[6]。

　　1.2.6  菌株对抗生素的敏感性  将菌株用富集培养基培养后，取10 μL接入含相应抗生素的LB培养基中，观察菌株在抗生素种类和浓度的敏感性。其中，抗生素的浓度分别为氨苄青霉素60 、20、10 μg/mL;卡那霉素50、10、2 μg/mL;链霉素50、10、2 μg/mL;氯霉素100、25、5 μg/mL。

　　2  结果与分析

　　2.1  氯氰菊酯降解菌的筛选

　　从生产氯氰菊酯的工厂附近采集样品，以氯氰菊酯为惟一碳源、氮源筛选具有降解农药能力的微生物。通过在含有氯氰菊酯的无机盐培养基中反复驯化以及无机盐平板上多次划线分离、纯化，初步得到9株降解氯氰菊酯的菌株。为维持降解菌降解能力的稳定性，后经进一步的复筛，将筛选得到的9株降解菌经过扩大培养、涂布含氯氰菊酯的无机盐平板，得到3株生长良好的降解菌。经紫外扫描分析，氯氰菊酯在278 nm处有最大吸收峰，确定一株高效降解氯氰菊酯的菌株，命名为DZS-3。图1为3 d内菌株DZS-3对氯氰菊酯降解情况及对照的紫外扫描图。

　　2.2  DZS-3对氯氰菊酯的降解率及降解趋势