灰树花胞外多糖发酵液的抗病毒作用研究(2)

　　（3）摇瓶发酵培养。采用500 mL挡板三角瓶，装液量100 mL，121 ℃高压常规灭菌20 min后，用破口的10 mL移液器吸取10%种子液（即从100 mL种子液中吸取含有10块菌丝体的种子液）移入以上挡板三角瓶，25 ℃，160 r·min-1培养10 d。

　　（4）发酵液处理。发酵结束后，将发酵液3 000 r·min-1离心20 min，上清过0.22 μm滤膜除菌后于4 ℃冰箱保存即可。

　　（5）苯酚硫酸法测定多糖含量[8]。

　　1.2.2 1%鸡红血球配制 用5 mL注射器吸取1 mL柠檬酸钠液，采集2～6月公鸡的红细胞，1 500 r，离心5 min，吸弃上清液。用生理盐水洗涤3次，1 500 r，前两次离心5 min，最后1次10 min。吸弃上清液，将沉积的红细胞配成1%红细胞悬液。（4±2） ℃储存，备用。

　　1.2.3 病毒的增殖 将新城疫病毒液50倍稀释后，接种于10日龄健康鸡胚，每枚鸡胚0.l mL，弃去24 h内死亡的鸡胚，收集48～72 h内死亡鸡胚尿囊液，加双抗后分装保存于-80 ℃冰箱备用。

　　1.2.4 病毒的滴定 在鸡胚水平测定病毒半数致死量（ELD50），将病毒液用0.9%生理盐水作连续10倍的倍比稀释，从10-3～10-9为止，每个稀释度经尿囊腔接种各5枚鸡胚，每枚0.l mL，每隔10 h照蛋。弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察至120 h，记录各胚死亡时间，按照Reed和Muench的方法计算病毒的半数致死量（ELD50）[9]。攻毒鸡胚的试验用病毒量为5×ELD50。

　　1.2.5 灰树花发酵胞外多糖对鸡胚的毒性试验 将3种浓度267，53.4，10.7 μg·mL-1的灰树花发酵胞外多糖发酵液接种到9～11日龄的鸡胚尿囊腔中，每种浓度接种20枚种蛋，接种量为0.l mL·枚-1，设对照组20枚，接种等量的无菌生理盐水。接种灰树花发酵胞外多糖发酵液后每隔12 h照蛋，记录死亡时间，连续观察直到144 h结束，最后根据存活鸡胚数计算灰树花发酵胞外多糖发酵液对鸡胚的毒性，确定无毒性最大浓度，该浓度即为对鸡胚的最大安全浓度。

　　1.2.6 灰树花胞外多糖发酵液抑制新城疫病毒致鸡胚致病试验 将24只试验鸡胚随机分为4组：1组为阴性对照组，接种病毒与生理盐水对照， 0.2 mL·枚-1， 2组为灰树花发酵胞外多糖原液（多糖含量为0.267 mg·mL-1），3组为灰树花发酵胞外多糖原液作10倍稀释，4组为生理盐水对照组（0.2 mg·mL-1）。将“灰树花发酵多糖”做10倍量稀释，并将不同稀释度药液分别与5×ELD50病毒液等体积混合均匀，37 ℃作用1 h后，分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各6枚，每胚接种0.2 mL，然后37 ℃继续孵化鸡胚，每24 h照蛋1次，并记录死亡情况，测定鸡胚尿囊液的血凝效价，直至l44 h试验结束。

　　2 结果与分析

　　2.1 NDV对鸡胚的半数致死量（ELD50）和血凝效价

　　由表1可知，新城疫毒株接种后2 d内鸡胚死亡。然后，在无菌条件下吸取尿囊液，用制备好的1%红细胞悬液进行凝集试验。经检测：病毒的血凝价为27～28，距离比例=（高于50%的百分数-50）/（高于50%的百分数-低于50%的百分数）=100-50/100-40=0.83。

　　Log ELD50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数（-1）=-8+0.83×（-1）=-8.83。即ELD50=8.83。

　　2.2 灰树花胞外多糖发酵液毒性试验结果

　　由表2可知，接种灰树花胞外多糖发酵液浓度为267，53.4，10.7 μg·mL-1的条件下，培养144 h后，鸡胚均发育良好，血管分布清晰、明显，证明该灰树花多糖发酵液对鸡胚实际无毒。

　　2.3 灰树花胞外多糖发酵液在鸡胚中的抑制新城疫病毒试验结果

　　鸡胚在接种新城疫病毒（阳性对照组）后48 h内死亡，死亡鸡胚全身出现严重出血、水肿，经照蛋器观察呈透明状态，解剖观察肝脏有坏死和出血点，出现溶血现象。接种试验结果如表3。

　　从表3中可以得出，接种灰树花胞外多糖发酵液组与阴性对照组相比，死胚率明显降低，尿囊液血凝效价也明显降低，说明灰树花胞外多糖发酵液能有效抑制增殖或杀灭新城疫病毒，从而能够明显降低鸡胚死亡率。

　　3 结论与讨论

　　新城疫病毒在鸡胚中增殖后主要释放到鸡胚尿囊液中。在一定条件下，新城疫病毒能使鸡红细胞发生血凝现象。如果在鸡胚内注入药物后， 尿囊液无血凝现象出现， 则表明药物在鸡胚内对新城疫病毒具有抑制或杀灭作用。药物对新城疫病毒的试验结果表明， 本实验室的一株灰树花菌株制备的胞外多糖发酵液液对5×ELD50的新城疫毒株有抑制或杀灭的作用，且随药物浓度的增加抗病毒作用效果增强， 但是对于灰树花制备的胞外多糖发酵液的抗病毒机理还有待于进一步研究。