拼接式毛细管电泳柱后蛋白质荧光衍生微膜反应器的构建与性能研究(2)

　　每天使用前，膜反应器用0.1 mol/L HCl、超纯水、0.1 mol/L NaOH、超纯水依次冲洗5 min。每5次进样后用0.1 mol/L NaOH、超纯水、分离缓冲液按照出峰的保留情况依次冲洗2～5 min。除特定指出外，电泳分离分析均在200 V/cm电压下进行，200 V/cm电进样10 s。
　　3 结果与讨论
　　3.1 膜长与荧光强度的关系
　　前期工作[15，16]中发现，1 mm膜长反应器死体积较大，本研究构建了膜长约为1.0 mm微膜反应器，并考察了膜长与荧光强度的关系，构建了拼接式微膜反应器（衍生试剂通过两根拼接毛细管之间的空隙进入反应池和目标物反应），并详细研究了其性能特征。图2是毛细管电泳激光诱导荧光检测系统的结构示意图。
　　以0.1 mg/mL BSA为样品，研究～1.0 mm膜长与荧光强度的关系，结果如图3所示。在相同实验条件下，荧光强度随着膜长度的增加而降低，并且峰型稍有展宽，柱效降低。表明两根毛细管之间的间隙已足够使得衍生试剂和待测目标物充分反应。因此，采用拼接的方式，结合膜的阻隔作用，可以更好地实现蛋白质的柱后衍生及荧光检测，避免过长的膜导致的较大死体积。
　　3.2 运行电压的影响
　　在拼接式微膜反应器系统中，运行电压通过影响电渗流速度而影响样品的衍生化反应时间，进而影响检测。运行电压过大，电渗流速度太大，导致膜内外溶液交换时间短，衍生试剂进入膜内量少，衍生反应不完全。同时， 运行电压过大，焦耳热效应对膜的损害也很大。图4为运行电压5～10 kV 时，0.1 mg/mL BSA衍生化产物荧光信号及保留时间的变化趋势。随着运行电压的减小，荧光强度呈略微增大趋势，但保留时间大大延长，导致分析周期过长。综合考虑两种因素，采用10 kV为运行电压。采用高于10 kV的运行电压可以加快分析时间，但是在所构建的系统中，焦耳热现象已经十分明显。
　　3.3 衍生试剂浓度的影响
　　NDA与β-ME反应的产物与氨基反应速度快，荧光量子产率高，已经被大量用于CE柱后衍生化系统。在前期工作[15，16]中已经对NDA、β-ME及蛋白质的最佳配比加以优化。但在拼接式柱后衍生CE-LIFD系统中，衍生化区段长度大大减小，相同条件下进入膜内的衍生化试剂量也相应地减少，因此，考察衍生试剂浓度对衍生化程度的影响十分必要。以0.1 mg/mL BSA为样品，分别考察不同衍生化试剂浓度对衍生化反应的影响，结果如图5所示。
　　由图 5 可见，随着衍生化试剂浓度的增加，BSA的荧光强度几乎没有变化，说明当衍生试剂的组成是100 mmol/L 硼酸盐缓冲液（pH 9.5）中含
　　3.4 荧光强度与蛋白质浓度间关系
　　如图6所示，当BSA浓度在0.007～0.04 mg/mL时，蛋白质浓度与荧光强度有良好的线性关系，线性回归方程为y=106.27x-0.5206 （R=0.9996）。以实验中基线峰值为噪声（0.012 mV）， 测得BSA 的检出限为0.34 μg/mL （S/N=3），即5.6 nmol/L。此结果与文献＼[17＼]报道的鞘流式柱后衍生反应器（8.6 nmol/L）处于同一数量级。图7为0.007 mg/mL BSA的电泳谱图。
　　3.5 系统死体积与柱效间关系
　　使用与拼接式柱后衍生微膜反应器具有相同内径、相同检测长度和相同总长度的空管柱作对照，使两者在相同条件下对相同浓度的BSA样品进行CZE分析，考察膜反应器对系统死体积及柱效的影响。实验中膜反应器的反应池内充满分离缓冲液。
　　相比于常规空管柱CZE分析，拼接式柱后衍生微膜反应器系统中的死时间和空管柱的死时间几乎相同， BSA峰宽说明柱效没有明显降低，相对于1 mm膜长反应器的CZE分析结果，分析系统的死体积大大降低，系统柱效得到显著提高。
　　3.6 分离能力和稳定性考察
　　用该微膜系统分离标准蛋白质BSA和Fetuin的混合物，结果如图8所示。两者分离度R=3.07，柱效分别为 1387和1285塔板数/m。
　　进一步对该系统的重复性及稳定性进行考察。连续进样3次， BSA和Fetuin保留时间的RSD分别为0.6%和0.3%；峰高的RSD分别为4.6%和3.2%。在连续进行35次后，微膜反应器依旧稳定，分离能力和柱效没有显著变化，说明其稳定性良好。
　　4 结 论
　　构建了拼接式毛细管电泳柱后蛋白质荧光衍生分离检测系统，考察了分离电压及衍生化试剂浓度等因素对衍生反应的影响，BSA浓度在0.007～0.04 mg/mL浓度范围内，荧光强度和样品浓度呈良好的线性关， BSA的检出限可达5.6 nmol/L。此反应器死体积较小，具有良好的稳定性和重现性。本研究为进一步将拼接式柱后衍生微膜反应器应用于复杂蛋白质样品的分离分析提供参考。